路武豪，郭文涛，冯　龙，娄卫华#

1)郑州大学第一附属医院咽喉头颈外科 郑州 450052　2)漯河医学高等专科学校病原生物学与免疫学教研室 漯河 462002　3)河南中医学院基础医学院病原生物学与免疫学科 郑州450008

稳定感染HPV-16 E6-E7的人喉咽鳞癌FaDu细胞生物学特性观察>*

路武豪1)，郭文涛2)，冯龙3)，娄卫华1)#

1)郑州大学第一附属医院咽喉头颈外科 郑州 4500522)漯河医学高等专科学校病原生物学与免疫学教研室 漯河 4620023)河南中医学院基础医学院病原生物学与免疫学科 郑州450008

关键词感染；HPV-16；人喉咽鳞癌；FaDu细胞

摘要目的：观察稳定感染HPV-16 E6-E7对FaDu细胞生物学行为的影响和调控。方法：全基因合成HPV-16 E6-E7基因，将其与慢病毒载体pLV-EGFP-C在T4连接酶作用下连接。制备重组HPV-16 E6-E7慢病毒并感染FaDu细胞。将细胞分3组：实验组(重组HPV-16 E6-E7慢病毒稳定感染的FaDu细胞)、载体对照组(慢病毒空载体稳定感染的FaDu细胞)和空白对照组(未感染慢病毒的FaDu细胞)。分别用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况，Transwell侵袭实验检测细胞的体外侵袭能力。结果：获得稳定感染重组HPV-16 E6-E7慢病毒的FaDu细胞，荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光蛋白EGFP表达。整合HPV-16 E6-E7基因的FaDu细胞增殖能力和侵袭力均增强，细胞凋亡率降低，S期和G2/M期细胞增加，G0/G1期细胞减少(P<0.05)。结论：成功建立了HPV-16 E6-E7基因整合的FaDu细胞。

喉咽鳞癌是头颈部鳞癌中常见的恶性肿瘤之一，某些高危型人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)被认为与鳞癌的发生密切相关[1]。研究[2-3]报道称在HPV感染相关的头颈部鳞癌中，关联性最强的型别为高危型HPV-16。尤其是HPV基因组早期区基因E6和E7编码产物即E6、E7蛋白，是导致其致癌的主要癌蛋白[4]。慢病毒载体是将基因整合入细胞的良好运载工具，操作简便，并且感染效率高、稳定、安全[5]。该研究通过重组HPV-16 E6-E7基因的慢病毒来感染人喉咽鳞癌FaDu细胞，观察稳定感染HPV-16 E6-E7对FaDu细胞生物学行为的影响和调控。

1材料与方法

1.1细胞人喉咽鳞癌FaDu细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2重组HPV-16 E6-E7慢病毒的制备和包装合成HPV-16 E6-E7基因，在T4连接酶的作用下与慢病毒载体pLV-EGFP-C进行连接，并转化入大肠杆菌DH5α，即获得重组HPV-16 E6-E7的慢病毒。提取HPV-16 E6-E7慢病毒质粒。参照包装说明将重组HPV-16 E6-E7慢病毒与辅助载体pH1、pH2按照一定比例混合，用无血清DMEM细胞培养基补足500 μL。充分混匀，室温静置15 min。

1.3细胞分组将细胞分为3组：实验组(重组HPV-16 E6-E7慢病毒稳定感染的FaDu细胞)、载体对照组(慢病毒空载体稳定感染的FaDu细胞)和空白对照组(未感染慢病毒的FaDu细胞)。

1.4E6、E7 DNA的PCR检测参照Qiagen公司基因组提取试剂盒提取HPV感染FaDu细胞的基因组DNA。PCR扩增鉴定E6、E7 DNA存在情况。E6上游引物5’-GGGATTTATGCATAGTATATAGA-3’，下游引物5’-CTTTTGACAGTTAATACACCT-3’，扩增片段长度为474 bp；E7上游引物5’-AACCGGACA GAGCCCATTAC-3’，下游引物5’-AATTCCTAGTGT GCCCATTAACA-3’， 扩增片段长度为297 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min;94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，34个循环；72 ℃末延伸1 min。PCR产物用20 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶分析系统照相。

1.6CCK-8法检测细胞增殖情况收集各组细胞并进行细胞计数，将各组细胞密度调整至1×105mL-1，按每孔1×104个细胞接种于96孔板内，各组均设置5个平行孔。在接种后的第1～5天，用CCK-8试剂盒检测各组细胞吸光度值，绘制细胞生长曲线。

1.7流式细胞术检测细胞周期用血清饥饿法对细胞进行同步化处理，使各组细胞周期停滞于G0期。每组收集1×106个细胞，加入预冷体积分数70%乙醇，-20 ℃固定30 min，离心去除乙醇，再用PBS洗涤2遍，加入含有10 mg/L的PI和质量分数为0.1%RNA酶的PBS，混匀，室温避光放置20 min，上流式细胞仪在488 nm波长处检测。实验重复5次。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡情况收集各组细胞，调整细胞密度为5×106mL-1，取1 mL细胞悬液，PBS洗涤2次。用100 μL冰预冷的缓冲液重悬细胞，并向细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和2.5 μL PI染液，轻轻混匀，置于冰上，流式细胞仪检测。实验重复5次。

1.9Transwell法检测各组细胞体外侵袭能力将Transwell 小室置于24 孔板中。收集转染6 h 的各组细胞，用含牛血清白蛋白的DMEM培养基重悬细胞。将Matrigel胶均匀铺于聚碳酸酯膜内面，在上室中分别加入100 μL各组细胞悬液，下室中加入500 μL含趋化因子的细胞培养基，37 ℃培养箱孵育48 h。显微镜下观察迁徙至膜上的细胞，每组设5个复孔，共重复5次，计数5个高倍视野中的细胞总数，即穿膜细胞数。

1.10统计学处理采用SPSS 17.0对实验结果进行统计学处理。不同组间细胞增殖能力、周期分布、侵袭能力的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1重组HPV-16 E6-E7慢病毒的制备与设计序列进行同源性比较，重组HPV-16 E6-E7慢病毒在靠近750 bp处有明亮条带，与目的基因完全一致，见图1。

M:DNA Marker；1：HPV-16 E6-E7。图1　重组HPV-16 E6-E7慢病毒电泳结果

2.2E6、E7 DNA的PCR检测在474 bp可见目的基因E6的条带，在297 bp处可见目的基因E7的条带，见图2。

1：E6；2：E7；M：DNA Marker。图2　E6、E7 DNA的PCR检测结果

2.3慢病毒稳定感染FaDu细胞后E6、E7 mRNA和蛋白的表达情况重组HPV-16 E6-E7慢病毒感染的FaDu细胞中可见明亮的绿色荧光蛋白EGFP的表达，见图3。稳定感染慢病毒的FaDu细胞E6和E7在mRNA和蛋白水平均呈高表达，见图4、表1。

2.4CCK-8法检测细胞增殖情况结果见图5、表2。

A:实验组；B:载体对照组；C:空白对照组。图3　各组细胞荧光显微镜观察结果(×40)

1：实验组；2：载体对照组；3：空白对照组；4：Hep-2细胞组。图4　各组细胞E6、E7蛋白的Western blot检测结果

组别nE6mRNAE7mRNA实验组52.600±0.220*1.800±0.120*载体对照组50.003±0.0010.003±0.001空白对照组50.002±0.0010.005±0.001Hep-2细胞组52.300±0.2101.700±0.110F255.400460.910P<0.001<0.001

*：与载体对照组和空白对照组相比，P<0.05。

A:空白对照组；B:载体对照组；C:实验组。图5　各组细胞培养第2天生长情况的比较(×40)

表2　各组细胞不同培养时间吸光度值的比较

*：与载体对照组和空白对照组相比，P<0.05。

2.5流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率结果见表3。

表3　各组细胞周期分布和细胞凋亡率比较　%

*：与载体对照组和空白对照组相比，P<0.05。

2.6Transwell实验结果见图6、表4。

A: 空白对照组；B: 载体对照组；C: 实验组。图6　各组细胞体外侵袭实验结果(×40)

组别n穿膜细胞数实验组5117.4±14.8*载体对照组568.4±8.2空白对照组572.0±8.1

F=19.950，P<0.001；*：与载体对照组和空白对照组相比，P<0.05。

3讨论

喉咽鳞癌是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤，患者以中老年男性为主。大量抽烟和(或)饮酒是主要致癌因素，然而有一部分患者并无大量抽烟和饮酒史，这部分患者可能与HPV感染有关。HPV是一类裸露闭合双链环状小DNA病毒，基因组全长约8 000 bp。HPV编码基因分为早期区基因、晚期区基因以及长控制区基因[6]。早期区E6、E7基因编码产物为E6、E7蛋白，能协同作用于细胞周期调节因子，使细胞停滞在S期，导致细胞基因突变的不断积累[7]。并且高危型HPV E6蛋白还能激活细胞端粒酶逆转录酶转录，协同E7蛋白灭活pRb，促进细胞永生化[8-9]。E6、E7被认为是HPV发挥致癌作用的主要癌蛋白。

为此，作者全基因合成了HPV-16 E6、E7基因，将其与慢病毒载体进行重组，感染FaDu细胞，获得了稳定表达HPV-16 E6-E7的FaDu细胞。分别观察感染HPV后细胞生物学行为的改变，结果发现实验组细胞第2、5天的吸光度值与载体对照组和空白对照组比较，均明显升高，说明感染HPV后细胞增殖能力明显增强。并且，细胞周期检测结果也显示：与空白对照组和载体对照组比较，实验组S期和G2/M期细胞增加，G0/G1期细胞减少，说明FaDu细胞基因组整合HPV-16 E6-E7可促进细胞分裂增殖。细胞凋亡检测结果显示：实验组与载体对照组和空白对照组比较，细胞凋亡率降低，说明HPV-16 E6-E7整合可抑制FaDu细胞的凋亡。Transwell实验结果显示：与载体对照组和空白对照组比较，实验组穿膜细胞数显著增加，说明整合HPV-16 E6-E7后细胞侵袭转移能力增强。

综上所述，该研究通过观察稳定感染HPV-16 E6-E7基因的人喉咽鳞癌FaDu细胞生物学行为的改变，推测E6、E7蛋白致肿瘤的作用机制，为进一步探讨HPV和人喉咽鳞癌的关系打下基础。

参考文献

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Biology characteristic observation of human laryngopharyngeal squamous cell carcinoma FaDu cells stably infected with HPV-16 E6-E7

LUWuhao1),GUOWentao2),FENGLong3),LOUWeihua1)

1)DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofPathogenBiologyandImmunology，LuoheMedicalCollege，Luohe4620023)DepartmentofPathogenBiologyandImmunology，CollegeofBasicMedicalSciences，HenanUniversityofTCM，Zhengzhou450008

Key wordsinfection;HPV-16;human hypopharyngeal squamous cell carcinoma;FaDu cell

AbstractAim: To observe the effect of HPV-16 E6-E7 gene integration on biological behavior of FaDu cells.Methods: Recombinant HPV-16 E6-E7 lentivirus was used to infect FaDu cells. CCK-8 was used to detect the cell proliferation. Flow cytometry was used to detected cell cycle and apoptosis. Transwell invasion assay was used to detected invasive ability. Results: Recombinant FaDu cells with infection by HPV-16 E6-E7 lentivirus expressed green fluorescent protein. The proliferation and invasiveness of FaDu cells with integration of HPV-16 E6-E7 enhanced, apoptosis was inhibited,S phase and G2/M phase cells increased, G0/G1 phase cells reduced(P<0.05).Conclusion: HPV-16 E6-E7 gene integration FaDu cell lines with integration of HPV-16 E6-E7 has been successfully established.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.009

#通信作者，男，1959年9月生，博士，教授，研究方向：咽喉头颈肿瘤学，E-mail:louweihuazzu@163.com

中图分类号R739.65

*河南省科技攻关计划项目112102310679