平　玉，李志勤，王　盟，胡金星，张　震，黄　岚，张　毅#

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052　2)郑州大学生命科学学院 郑州 450001　3)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 450052　4)郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052

干扰素联合利巴韦林对慢性丙型肝炎患者CD8+T细胞亚群功能的影响*

平玉1,2)，李志勤3)，王盟4)，胡金星3)，张震1)，黄岚1)，张毅1,2)#

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 4500522)郑州大学生命科学学院 郑州 4500013)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 4500524)郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052

关键词干扰素；利巴韦林；慢性丙型肝炎；CD8+ T细胞

摘要目的：探讨干扰素联合利巴韦林对慢性丙型肝炎患者外周血中CD8+ T细胞亚群功能的影响。方法：密度梯度离心法从慢性丙型肝炎患者外周血中获取外周血单个核细胞，体外给予干扰素和(或)利巴韦林处理。用流式细胞术检测外周血单个核细胞中CD8+ T细胞分泌干扰素γ和穿孔素(Perforin)的水平；用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血单个核细胞中干扰素相关基因IRF7和IFIT1的表达。结果：细胞内因子检测发现干扰素联合利巴韦林处理能增加CD8+ T细胞中效应性T细胞分泌干扰素γ和Perforin的水平(P<0.05)，同时能增加中心记忆性T细胞和效应记忆性T细胞分泌Perforin的水平(P<0.05)；基因转录水平的检测发现干扰素联合利巴韦林处理后干扰素调节基因IFIT1的表达增加(P<0.05)。结论：慢性丙型肝炎患者的外周血单个核细胞体外经干扰素联合利巴韦林处理后，CD8+ T细胞的杀伤功能增强。

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)引起的[1]，可分为急性丙型肝炎和慢性丙型肝炎。HCV在机体内的持续存在是引起慢性丙型肝炎的主要原因[1]。大量研究[2-3]表明，CD8+T细胞在控制病毒复制及感染的过程中发挥着重要的作用，然而在慢性丙型肝炎患者中大部分CD4+T细胞和CD8+T细胞都出现功能失调的现象。这说明HCV能直接或间接抑制T细胞功能的发挥。目前，临床上干扰素联合利巴韦林是治疗慢性丙型肝炎的常用方案。近年来，一系列小分子药物的出现，为慢性丙型肝炎的治疗带来了曙光[4-5]。然而，由于这些小分子药物只在部分发达国家广泛应用，在我国慢性丙型肝炎的治疗仍以干扰素联合利巴韦林为标准。该研究以初治慢性丙型肝炎患者为研究对象，在体外从细胞学的角度观察干扰素及利巴韦林对CD8+T细胞亚群功能的影响。

1材料与方法

1.1材料收集2014年8月至2015年8月郑州大学第一附属医院收治的慢性丙型肝炎患者的外周血。所有病例均为初治慢性丙型肝炎患者，入院前未进行任何抗病毒治疗。RPMI 1640培养基、胎牛血清购自HyClone公司，人外周血淋巴细胞分离液购自天津灏阳公司，SYBR GREEN染料和Trizol购自TaKaRa公司，流式荧光抗体均购自BD公司，CD8磁珠购自美天妮公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2外周血单个核细胞的分离 取一支50 mL离心管，将10 mL血加入到离心管中，加生理盐水稀释至20 mL；另取一支50 mL离心管，加入10 mL的人外周血淋巴细胞分离液；用无菌吸管小心地将稀释后的血液缓缓加于淋巴细胞分离液的液面上；18～22 ℃、2 500 r/min离心20 min；然后用无菌吸管小心吸取淋巴细胞层于另一个无菌的离心管中，加入适量生理盐水，1 500 r/min离心10 min；然后弃上清，再加入适量的生理盐水重悬细胞，1 500 r/min离心10 min，得到的沉淀即外周血单个核细胞。

1.3外周血单个核细胞体外处理及培养提取的外周血单个核细胞铺于24孔板中，每孔1×106个细胞，设置4组，分别是对照组、干扰素处理组、利巴韦林处理组和干扰素联合利巴韦林处理组(简称联合处理组)。人重组干扰素α-2a的浓度为10 U/L，利巴韦林的浓度为100 mg/L，各组加药处理时间均为12 h。密度梯度离心法得到的外周血单个核细胞体外加药处理12 h后，以CCR7和CD45RA来鉴定CD8+T细胞的4个亚群：CCR7-CD45RA-的CD8+T细胞为效应记忆性T细胞(TEM)；CCR7+CD45RA-的CD8+T细胞为效应性T细胞(TEMRA)；CCR7-CD45RA+的CD8+T细胞为中心记忆性T细胞(TCM)；CCR7+CD45RA+的CD8+T细胞为初始T细胞(NC)[6]。

1.4细胞内因子检测每孔细胞加药处理12 h后，分别加入PMA(50 mg/L)、离子霉素(750 mg/L)、阻断剂，刺激6 h左右。将24孔板里的细胞置于1.5 mL的离心管中，用生理盐水清洗2遍，避光，加表面抗体CD3-PE-cy7、CD8-Percp、CCR7-PE、CD45RA-FITC，4 ℃孵育20 min；加200 μL固定剂，4 ℃避光孵育30 min；加400 μL破膜剂，4 ℃避光孵育1 h；加胞内抗体干扰素γ-APC和穿孔素(Perforin)-APC-cy7，4 ℃避光孵育30 min。上流式细胞仪检测细胞分群及细胞因子分泌情况。实验重复3次。

1.5磁珠分选将加药处理后的细胞置于离心管中，用磁分选缓冲液洗2遍。计数细胞，每1×107个细胞中加20 μL的CD8磁珠和80 μL的磁分选缓冲液，4 ℃孵育20 min。孵育后离心管中加适量磁分选缓冲液，1 500 r/min离心10 min，同时将柱子置于磁场中，用磁分选缓冲液润湿一下；离心后，加1 mL磁分选缓冲液重悬细胞，将细胞悬液缓缓打入柱子中；待柱子中的细胞悬液滴完后，加磁分选缓冲液洗柱子3遍；最后，将柱子里的细胞通过注射器施压打入到另一无菌的离心管中，得到的细胞为CD8+T细胞。

1.6实时荧光定量聚合酶链反应检测干扰素调节基因IRF7、IFIT1的表达[7-8]内参GAPDH的引物序列为：上游5’-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，下游5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3’；IRF7的引物序列为：上游5’-GCTGGACGTGACCATCATG TA-3’，下游5’-GGGCCGTATAGGAACGTGC-3’；IFIT1的序列为：上游5’-TTGATGACGATGAAATGCCTGA-3’，下游5’-CAGGTCACCAGACTCCTCAC-3’。 磁分选得到的CD8+T细胞离心取沉淀；将沉淀用1 mL的Trizol重悬，提RNA，反转录；以2 μL cDNA为模板，加10 μL SYBR GREEN染料、1 μmol/L的上下游引物各4 μL，共20 μL反应体系。反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s，共40个循环；72 ℃ 10 min。均设3个复孔，结果以2-ΔΔCt表示。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0进行数据分析。不同组间干扰素γ、Perforin及IRF7、IFIT1 mRNA相对表达量的比较均采用2×2析因设计的方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1干扰素联合利巴韦林对CD8+T细胞4个亚群比例的影响结果见表1。

表1　4组中CD8+ T细胞4个亚群的比例　%

2.2干扰素联合利巴韦林对CD8+T细胞4个亚群干扰素γ分泌的影响结果见表2。

表2　4组中CD8+ T

2.3干扰素联合利巴韦林对CD8+T细胞4个亚群Perforin分泌的影响结果见表3。

表3　4组中CD8+ T

2.4干扰素联合利巴韦林对CD8+T细胞干扰素调节基因IRF7、IFIT1表达的影响结果见表4。

表4　4组IRF7和IFIT1基因的表达

3讨论

该研究通过体外给予干扰素及利巴韦林，探究其对CD8+T细胞亚群功能的影响。体外联合给药后，慢性丙型肝炎患者中CD8+T细胞各亚群的功能都有所改善，为临床上的有效治疗提供了实验基础。然而，尽管机体产生了这些反应，HCV仍然能够在肝组织内复制，引起肝组织的损伤[9]。在慢性丙型肝炎患者中，病毒能够不断复制，CD8+T细胞以及CD4+T细胞处于功能缺失的状态[9]。而CD8+T细胞效应功能在病毒的清除及疾病的进展过程中发挥着至关重要的作用。Wang等[10]研究发现，干扰素γ高表达CD38低表达的CD8+T细胞能够有效清除病毒，相反的，干扰素γ低表达CD38高表达与肝组织的损伤及炎症的持续存在有密切的关系。Jo等[11]研究发现，Perforin在病毒感染的过程中能够调节CD8+T细胞对靶细胞的杀伤。该研究发现，慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞在干扰素联合利巴韦林处理后T细胞分泌杀伤性因子干扰素γ和Perforin升高，证明这种T细胞无能的状态在体外给予干扰素和利巴韦林处理后能够改善，如CD8+T细胞的4个亚群的比例有所变化，功能有所提高。

Thomas等[8]研究发现，利巴韦林与干扰素联合治疗能够显著升高干扰素调节基因的表达。然而，该研究发现，与对照组相比，体外给予干扰素和利巴韦林后，干扰素调节基因IRF7表达升高，但差异无统计学意义；IFIT1的表达升高，且差异有统计学意义，但是与干扰素处理组相比，联合处理组IFIT1的表达有降低的趋势，与Thomas等[8]的研究发现不一致。Wieland等[12]研究发现病毒感染能够使细胞中干扰素调节基因表达升高。基于该研究，作者认为联合处理组IFIT1的表达低于干扰素处理组可能与利巴韦林能够抑制病毒在细胞中的复制有关，进而使IFIT1的表达降低。该研究发现体外联合使用干扰素和利巴韦林后，慢性丙型肝炎患者CD8+T细胞中TEMRA亚群干扰素γ和Perforin的分泌量增加。结合相关研究[8]，作者认为干扰素影响CD8+T细胞的功能可能是通过信号转导子和转录激活子信号通路来实现的。

综上所述，该研究发现，与对照组相比，体外给予干扰素和利巴韦林后，慢性丙型肝炎患者CD8+T细胞4个亚群的比例有升高的趋势，但差异无统计学意义，TEMRA亚群中干扰素γ和Perforin的分泌量增加，同时，也上调了干扰素调节基因IFIT1的表达。体外进一步研究临床抗病毒药物对CD8+T细胞功能影响的相关机制，可为以后慢性丙型肝炎的治疗提供更为有力的实验依据，并为小分子抑制药物的研究与开发提供一定的实验基础。

参考文献

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[5]RUANE PJ,AIN D,STRYKER R,et al.Sofosbuvir plus ribavirin for the treatment of chronic genotype 4 hepatitis C virus infection in patients of Egyptian ancestry[J].J Hepatol,2015,62(5):1040

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Effect of interferon plus ribavirin on CD8+T cells function in patients with chronic hepatitis C virus infection

PINGYu1,2),LIZhiqin3),WANGMeng4),HUJinxing3),ZHANGZhen1),HUANGLan1),ZHANGYi1,2)

1)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500013)DepartmentofInfectiousDiseases,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500524)DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsinterferon;ribavirin;chronic hepatitis C;CD8+ T cell

AbstractAim: To evaluate the function of CD8+ T cells from patients with chronic hepatitis C virus after treated with interferon plus ribavirin.Methods: Peripheral blood mononuclear cells were isolated from whole blood by density gradient centrifugation and seeded into 24-well plate before treatment with interferon and(or) ribavirin. The secretion of IFN-γ and Perforin was detected by flow cytometry. Real time PCR was used to detect the expression of interferon regulatory factors IRF7 and IFIT1.Results: Compared with control, being treated with interferon plus ribavirin could increase the levels of INF-γ and Perforin secreted by effective T cells(P<0.05).In addition, Perforin secreted by effect memory T cells and centre memory T cells also increased(P<0.05). The expression of interferon regulatory factor IFIT1 up-regulated simultaneously(P<0.05).Conclusion: Interferon plus ribavirin may enhance the function of CD8+ T cells.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.008

#通信作者，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向：肿瘤免疫，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

中图分类号R392.12

*国家自然科学基金面上项目81271815