门颖丽，康巧珍，王小龙，杜明宣，黄夏冰，张亚萌，汲振余，王　婷，刘　鑫#

1)郑州大学生命科学学院分子免疫实验室 郑州 450001　2)河南省医药科学研究院肿瘤科 郑州 450052

MBP在小鼠肝癌H22荷瘤模型中的抗肿瘤作用>*

门颖丽1)，康巧珍1)，王小龙1)，杜明宣1)，黄夏冰1)，张亚萌1)，汲振余2)，王婷1)，刘鑫1)#

1)郑州大学生命科学学院分子免疫实验室 郑州 4500012)河南省医药科学研究院肿瘤科 郑州 450052

关键词麦芽糖结合蛋白；小鼠肝癌H22荷瘤模型；Th1；Th17

摘要目的：探讨大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)在小鼠肝癌H22荷瘤模型中的抗肿瘤作用及可能机制。方法：将12只6～8周龄的BALB/c小鼠皮下注射2×106个H22细胞，建立荷瘤模型，荷瘤后第2天将小鼠分为PBS组和MBP组，每组6只，并通过皮下瘤旁注射给药的方式进行干预，期间监测肿瘤体积和小鼠体重变化，测量肿瘤和各脏器质量，ELISA法检测脾细胞分泌IL-12和IFN-γ的水平，Real-time PCR检测肿瘤组织中IFN-γ和IL-17A mRNA的相对表达量。结果：MBP能抑制肿瘤的生长(P<0.05)。与PBS组相比，MBP组小鼠脾细胞中IL-12、IFN-γ分泌量上升，肿瘤组织中IFN-γ mRNA的表达量上升，IL-17A mRNA的表达量下降(P<0.05)。结论：MBP能够有效抑制肝癌H22肿瘤生长，其作用可能是通过激活Th1型免疫反应和抑制Th17型免疫反应。

大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)是大肠杆菌体内参与麦芽糖转运的一个功能蛋白，由大肠杆菌的malE基因所编码。2007年首次证实MBP是一种TLR4激动剂，能够刺激树突状细胞的成熟并促进其分泌IL-12等炎性细胞因子，激活机体固有免疫反应[1]。随后有研究[2]证实MBP能够作用于脾淋巴细胞，诱导非特异性及特异性Th1型免疫反应。近年来，MBP在肿瘤免疫治疗中的潜力受到人们关注，被证实能够增强肿瘤疫苗MUC1以及免疫调节剂BCG的肿瘤抑制作用[3]。在该研究中，作者通过建立小鼠肝癌H22荷瘤模型，观察MBP的抗肿瘤作用并对其作用机制进行了初步探讨。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂携带MBP基因的质粒pMAL-c2X购于美国纽英伦生物技术公司；表达菌株为E.coliK12 TB1，由郑州大学生命科学学院分子免疫实验室保存；MBP蛋白通过Amylose Resin(美国纽英伦生物技术公司)亲和层析纯化获得，MBP蛋白浓度为0.002 5 mg/L，蛋白纯度为98%；BCA蛋白定量试剂盒和RPMI 1640培养基购于北京索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司；IFN-γ ELISA检测试剂盒购于美国Biolegend公司；Real-time PCR引物由美国Invitrogen公司合成；Trizol、SYBR Premix Ex TaqⅡ酶及荧光定量逆转录试剂盒购于大连宝生物工程有限公司。

1.1.2实验动物6～8周龄、SPF级雌性BALB/c小鼠12只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001。饲养于河南省医药科学研究院SPF级动物室，实验过程中动物自由饮食、饮水，光照周期为12 h/12 h。

1.1.3肿瘤细胞小鼠肝癌H22细胞系由河南省医药科学研究院惠赠，培养并保存于郑州大学生命科学学院分子免疫实验室。

1.2小鼠肿瘤模型的建立及分组处理将2×106个肝癌H22细胞以0.2 mL皮下注射到BALB/c小鼠左前肢腋下，荷瘤后第2天将小鼠采用随机数字表法分为2组：PBS组(n=6)和MBP组(n=6)，PBS组每只注射0.2 mL PBS， MBP组每只注射0.2 mL 40 μg的MBP， 连续注射7 d，期间每天测量小鼠体重并用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积。

1.3小鼠各脏器和肿瘤质量比较荷瘤后第8天处死小鼠，解剖得到小鼠心、肝、肺、肾以及肿瘤组织，称重并计算各脏器系数[4]。

1.4ELISA法检测脾细胞IL-12和IFN-γ的分泌

荷瘤后第8天处死小鼠，解剖后无菌取脾脏，制备成单个脾细胞悬液，调整细胞密度为1×107mL-1，以每孔500 μL的量加入到48孔板中，同时加入PBS或终浓度为3 μmol/L的MBP刺激，培养48 h后收集培养上清。ELISA法检测上清中IL-12和IFN-γ的水平[5-6]。

1.5Real-time PCR检测肿瘤组织中细胞因子的表达取约60 mg肿瘤组织，Trizol法提取总RNA，并逆转录成cDNA，进行Real-time PCR反应检测IL-17A和IFN-γ mRNA的相对表达量。内参β-actin上游引物5’-GTGGCATCCATGAAACTACAT-3’，下游引物5’-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3’，产物大小71 bp；IFN-γ上游引物5’-TCAAGTGGCATAGATGTG GAAGAA-3’，下游引物5’-TGGCTCTGCAG GATTTTCATG-3’，产物大小92 bp；IL-17A上游引物5’-GCAAGAGATCCTGGTCCTGA-3’，下游引物5’-AG CATCTTCTCGACCCTGAA-3’，产物大小69 bp。PCR反应体系25 μL：2×SYBR Premix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL。反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，共40个循环。融解曲线：60 ℃梯度升温至95 ℃，每℃停留5 s。采用2-ΔΔCt法计算IL-17A和IFN-γ的相对表达量。

1.6统计学处理应用SPSS 21.0进行统计学处理。采用重复测量数据的方差分析比较不同处理因素作用后不同时间点小鼠体重和肿瘤体积的差异，采用两独立样本的t检验或秩和检验比较2组小鼠肿瘤质量、脏器系数、肿瘤组织中IL-17A和IFN-γ mRNA相对表达量、脾细胞培养上清中IL-12和IFN-γ水平的差异。检验水准α=0.05。

2结果

2.12组小鼠肿瘤体积、质量的比较荷瘤1～2 d，2组小鼠肿瘤体积均为0 mm3;荷瘤3 d后，MBP组和PBS组成瘤率均达到100%，且MBP组肿瘤体积小于PBS组(表 1)。另外，MBP组肿瘤质量低于PBS组(表 2)。

表1　2组小鼠肿瘤体积的比较　mm3

F组间=46.828，P<0.001；F时间=93.130,P<0.001；F交互=10.747，P<0.001。

表2　2组小鼠肿瘤质量的比较　g

t=4.633,P=0.002。

2.22组小鼠体重及各脏器系数的比较结果显示，PBS组和MBP组小鼠体重及各脏器系数比较，差异均无统计学意义，见表3、4。

表3　2组小鼠体重的比较　g

F组间=0.917，P=0.366；F时间=1.617，P=0.150；F交互=0.385，P=0.907。

表4　2组小鼠各脏器系数测定结果　%

2.32组小鼠脾细胞分泌IL-12和IFN-γ情况的比较结果见表5。

表5　2组小鼠脾细胞培养

2.42组小鼠肿瘤组织中IFN-17A、IFN-γ mRNA相对表达量的比较结果见表6。

表6　2组小鼠肿瘤组织中

3讨论

该研究中，作者利用小鼠肝癌H22荷瘤模型探究MBP的抗肿瘤作用。结果显示，相对于PBS组，MBP组小鼠的肿瘤生长缓慢，肿瘤质量降低，而2组小鼠的体重、脏器系数均无明显变化。这说明此剂量下的MBP在发挥出明显抗肿瘤作用的同时，并没有表现出明显的毒性。

IL-12是固有免疫细胞特别是树突状细胞的主要效应细胞因子，IL-12的表达量上升预示着固有免疫反应的激活。同时，IL-12能够促进下游T细胞向Th1型分化，因此IL-12也是连接固有免疫和适应性免疫反应的桥梁。作者发现，在小鼠肝癌H22荷瘤模型中，MBP能够增强脾细胞分泌IL-12的能力，这表明MBP能够激活固有免疫反应，同时对于T细胞向Th1型分化具有潜在作用。

Th1型免疫反应被认为在抗肿瘤免疫中起到重要的作用，IFN-γ是重要的Th1型细胞因子[7]，Th1型细胞通过分泌IFN-γ促进脾脏和淋巴结中免疫细胞的成熟及功能的发挥，增强机体免疫监视功能[8]。另外，肿瘤组织中浸润的Th1细胞通过分泌IFN-γ诱导巨噬细胞、CD8+T 细胞等浸润到肿瘤部位，进而对肿瘤细胞产生杀伤作用[9-11]，同时IFN-γ也能直接或间接作用于肿瘤基质细胞,抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长[12]。该实验结果显示，MBP组小鼠脾细胞所分泌的IFN-γ及其肿瘤组织中IFN-γ的表达量都显著升高，说明MBP能够诱导免疫系统和肿瘤部位的Th1型免疫反应，从而发挥抗肿瘤作用。

肿瘤微环境的炎性环境及某些炎性细胞因子对于肿瘤细胞逃脱免疫监视具有重要意义[13]。IL-17A是由Th17细胞分泌的炎性细胞因子。临床研究[14]发现，IL-17A在肿瘤组织中高表达，并且IL-17A的表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关；IL-17A在肿瘤微环境中可促进肿瘤血管生成以及形成炎性微环境，从而促进肿瘤的生长和逃脱免疫监视。该研究中，相对于PBS组，MBP组肿瘤组织中IL-17A的表达量显著下降。说明MBP可抑制肿瘤微环境中Th17型免疫应答，下调IL-17A，进而抑制肿瘤免疫逃逸。

综上所述，该研究证实，在小鼠肝癌H22荷瘤模型中，MBP抑制肿瘤生长，增强脾淋巴细胞及肿瘤微环境中IFN-γ的表达，同时降低肿瘤微环境中炎性因子IL-17A的表达。MBP对小鼠体重及脏器未见明显影响，因而具有成为抗肿瘤候选药物的潜力。

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Anti-tumor effect of MBP in murine H22 hepatocarcinoma model

MENYingli1),KANGQiaozhen1),WANGXiaolong1),DUMingxuan1),HUANGXiabing1),ZHANGYameng1),JIZhenyu2),WANGTing1),LIUXin1)

1)LaboratoryofMolecularImmunology,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofOncology,HenanAcademyofMedical&PharmaceuticalSciences,Zhengzhou450052

Key wordsmaltose-binding protein;murine H22 hepatocarcinoma model;Th1;Th17

AbstractAim: To explore the antitumor efficacy and the mechanism of maltose-binding protein(MBP) in murine H22 hepatocarcinoma model.Methods: A total of 2×106 H22 hepatoma cells were subcutaneously injected into the flank of twelve female 6-8 weeks BALB/c mice, respectively. The next day, mice were divided into two groups and treated with PBS or MBP, respectively. Tumor growth and body weight were monitored every day. Tumor and visceral organs were harvested, then tumor weight and visceral index were measured.The level of IL-12 and IFN-γ in supernatant of splenocytes was detected by ELISA assay, and the mRNA expressions of IFN-γ and IL-17A in tumor tissue was determined using Real-time PCR.Results: Compared with PBS group, MBP significantly suppressed tumor growth(P<0.05). Compared with PBS group,splenocytes of MBP group secreted the relative higher levels of IL-12 and IFN-γ,IFN-γ mRNA expression in tumor tissue increased, and IL-17A mRNA expression in tumor tissue decreased(P<0.05).Conclusion: The MBP has antitumor potential, which may be explained by its effects on activating Th1 immune response and inhibiting Th17 immune response.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.007

#通信作者，女，1981年7月生，博士，讲师，研究方向：免疫性疾病的发病机制及治疗，E-mail：liux@zzu.edu.cn

中图分类号R730.59

*重大新药创制科技重大专项项目2012ZX09103301-022；国家自然科学基金资助项目U1204817，81373119