梁东晓，王雪晶，丁雪冰,何一昕，潘鹏伟，刘丹丹，滕军放#

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052　2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

肌萎缩侧索硬化患者脑脊液对U251细胞隧道纳米管形成的影响>*

梁东晓1)，王雪晶1，2)，丁雪冰1，2),何一昕1)，潘鹏伟1)，刘丹丹1)，滕军放1，2)#

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 4500522)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

关键词肌萎缩侧索硬化；脑脊液；U251细胞；隧道纳米管

摘要目的：探讨肌萎缩侧索硬化(ALS)患者脑脊液对神经胶质细胞隧道纳米管(TNTs)形成的影响。方法：收集16例ALS患者的脑脊液(ALS-CSF)及10例功能性头痛患者的脑脊液(对照)，分别用于培养U251细胞0、3、7、10、14 d，采用免疫荧光显微镜观察TNTs的形成，记录表达TNTs结构的U251细胞百分比，采用Western blot法检测ALS-CSF培养0、3、7、10、14 d后U251细胞中F-actin蛋白的表达。结果：在ALS-CSF培养条件下, 表达TNTs结构的U251细胞百分比较对照组增加(P<0.05)，且表达TNTs结构的U251细胞百分比在3 d时开始增加，7 d时达到高峰，10 d时开始逐渐下降；ALS-CSF培养的U251细胞F-actin表达量在3 d时升高，在7 d时表达量最高，在10 d时开始下降。结论：ALS-CSF培养的U251细胞在早期可诱导TNTs的形成，可能促使ALS相关致病蛋白通过TNTs在中枢神经系统中播散。

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是以选择性,进行性上、下运动神经元损害并存为显著特征的慢性神经系统变性疾病。临床表现为自肢体远端开始的非对称性肌无力和肌萎缩，是成人运动神经元病最常见的类型。ALS发病机制不明。研究[1-2]证实ALS患者残存神经元及胶质细胞内存在异常的蛋白聚集物——TDP-43免疫反应阳性包涵体，其在中枢神经系统中的播散可能是ALS的核心病理机制,但TDP-43免疫反应阳性包涵体在中枢神经系统中的播散方式仍不明。有学者[3]对20余例ALS患者尸检病理结果研究后提出：TDP-43免疫反应阳性包涵体沿突触顺行及逆行方式在神经元及胶质细胞间播散或通过脑脊液播散是ALS的主要病理机制。隧道纳米管(tunneling nanotubes, TNTs)是哺乳动物细胞间一种新型的通讯链接方式[4],主要负责细胞器的转运，例如信号分子Ca2+、线粒体、细胞内小泡、高尔基体、内质网。近期研究[5-6]发现蛋白聚集体、朊蛋白等也可通过TNTs在细胞间转运，TNTs可能为神经退行性疾病相关包涵体在中枢神经系统播散提供途径。该研究通过建立脑脊液-细胞模型，观察ALS患者脑脊液对人星形胶质细胞瘤细胞U251 TNTs形成的影响,探讨ALS患者脑脊液促进相关致病包涵体播散的病理机制。

1对象与方法

1.1研究对象收集2014年6月至2015年6月在郑州大学第一附属医院确诊的散发性ALS患者16例，均经过详细的神经科、神经影像、神经电生理及血液学检查，诊断均符合1998年世界神经病学联盟E1 Escorial诊断标准(修订版),其中男11例，女5例，年龄39～53(46.0±5.3)岁。对照组为同期就诊的功能性头痛患者10例，其中男6例，女4例，年龄49～62(56.0±4.2)岁，无明显神经系统症状、无神经系统炎性及退行性病变，神经系统体格检查无异常。该研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，全部患者均签署知情同意书。

1.2标本采集对受试者行腰椎穿刺术，采集脑脊液标本10～15 mL(弃去可视血性脑脊液)，并分装至1.5 mL的聚丙烯管，置于-80 ℃液氮罐中保存。

1.4TNTs的形成检测采用细胞免疫荧光化学技术。在37 ℃避光条件下，使用 Alexa Fluor 488 Phalloidin(瑞士Invitrogen 公司)分子探针对TNTs进行标记。在室温条件下将细胞用40 g/L的多聚甲醛固定10 min，用PBS漂洗，加入体积分数0.25% Triton X-100静置15 min，用100 g/L的牛血清白蛋白封闭1 h，加入Alexa Fluor 488 Phalloidin室温下孵育1 h。使用荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)观察Alexa Fluor 488 Phalloidin(绿色荧光)标记的TNTs的形成，高倍镜下拍摄照片，用Image-Pro Plus 7.0图像分析软件测定表达TNTs的U251细胞百分比。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。不同培养条件及培养不同时间对表达TNTs结构的U251细胞百分比的影响采用2×5析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2结果

2.1U251细胞培养后TNTs的形成结果见图1。由图1可见ALS-CSF培养的U251细胞间存在典型的TNTs结构连接(箭头所示)。

2.2两组U251细胞中表达TNTs的U251细胞百分比的比较见表1。由表1可知，ALS-CSF组表达TNTs结构的U251细胞百分比高于NC-CSF组。ALS-CSF组表达TNTs结构的U251细胞百分比先上升，到7 d时达到高峰，随后逐渐下降。

图1　U251细胞经ALS-CSF培养后TNTs的形成(×400)

%

F组别=29 073.984，P<0.001；F时间=3 311.226，P<0.001；F交互=2 267.715，P<0.001。

2.3ALS-CSF组F-actin蛋白的表达结果见图2。由图2可见，培养3 d时U251细胞中F-actin蛋白表达量升高，7 d时最高，10 d时开始减少。

图2　Western blot检测ALS-CSF组F-actin蛋白的表达

3讨论

ALS是一种进行性神经系统变性疾病。目前医学领域对该病的病因、发病机制认识尚不明确，尚无有效治疗方法[7]，患者最终多死于呼吸肌麻痹或并发呼吸道感染。

近年来，研究[3]表明ALS的病程进展与TDP-43免疫反应阳性包涵体在中枢神经系统的播散密切相关。研究[8-10]表明ALS患者脑脊液中TDP-43蛋白的含量增加，使用ALS患者脑脊液培养神经细胞可对神经细胞产生损害。ALS-CSF可能为TDP-43免疫反应阳性包涵体在中枢神经系统的播散提供了载体，但TDP-43免疫反应阳性包涵体在神经元及胶质细胞间的转运方式仍不明确。

TNTs又称膜纳米管，是一种新发现的细胞间通讯途径。2004年，Rustom等[11]在大鼠嗜铬细胞瘤细胞中首次发现一种奇特的纳米级纤细长管，又用多组实验证明了这是一种新型的细胞连接方式，并将其命名为TNTs。随后人们陆续在免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等细胞中发现这种物理性质的连接，表明TNTs作为细胞间相互交流的通道在动物细胞中普遍存在[12-13]。TNTs是由表层的细胞膜和内部的细胞骨架构成，一直处于形成和断裂的持续变化状态之中；作为贯穿其中的特征性结构，丝状肌动蛋白F-actin不仅调节着TNTs的长度变化，同时在相连接的细胞间形成了复杂的通信网络，介导了细胞间的物质运输和信号交流，从而在多种生理过程中发挥着重要的作用[14]。目前研究[15-16]发现诱导TNTs形成的机制包括：Rho GTPase、Fas、P53/AKT/PI3K、M-sec/Ral/exocyst信号通路的激活；而化学刺激、机械力以及长时间的光照能够引起TNTs的断裂，抑制微丝形成的药物Latrunculin B 和Cytocalasin D也能够抑制TNTs的形成。TNTs主要负责细胞器的转运，例如信号分子Ca2+、线粒体、细胞内小泡、高尔基体等。随后的研究[6，17]显示多种蛋白聚集体、病毒等可通过TNTs在神经细胞间传递。TNTs可能为神经退行性疾病相关包涵体在中枢神经系统的播散提供了高效的细胞间通道。

该研究使用ALS-CSF培养U251细胞建立脑脊液-细胞模型，结果发现在ALS-CSF培养条件下,表达TNTs结构的U251细胞百分比较NC-CSF组增加，ALS-CSF培养的U251细胞中表达TNTs的U251细胞百分比和F-actin表达量均在3 d时升高，7 d时表达量最高，10 d时开始减少。以上结果表明ALS-CSF培养的U251细胞在早期可诱导TNTs的形成。TNTs可能是ALS相关致病蛋白在中枢神经系统传播的途径，抑制TNTs的形成、阻断神经细胞间的信息传递可能对防止神经元的退行性病变或损伤、延缓或阻止ALS病情的发展有重要意义。

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(2015-10-15收稿责任编辑徐春燕)

Effects of cerebrospinal fluid from patients with amyotrophic lateral sclerosis on generation of tunneling nanotubes-like structure in U251 cells

LIANGDongxiao1)，WANGXuejing1,2)，DINGXuebing1,2),HEYixin1)，PANPengwei1)，LIUDandan1)，TENGJunfang1,2)

1)DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

Key wordsamyotrophic lateral sclerosis;cerebrospinal fluid;U251 cell;tunneling nanotube

AbstractAim: To investigate the effects of cerebrospinal fluid from patients with amyotrophic lateral sclerosis(ALS-CSF) on the generation of tunneling nanotubes(TNTs)-like structure in the human glioma U251 cells.Methods: CSF was collected from 16 ALS patients and 10 persons with functional headache(control) and used to culture U251 cells for 0，3，7，10，14 days,respectively. The generation of TNTs was observed under fluorescence microscope, and the percentage of U251 cells with TNTs among U251 cells was recorded. Then Western blot was used to detect the expression of F-actin in U251 cells cultured with ALS-CSF for 0，3，7，10，and 14 days.Results: The percentage of U251 cells with TNTs among U251 cells cultured with ALS-CSF was higher than control, which started to increase at day 3, and reached the peak at day 7, then gradually decreased from day 10. The expression of F-actin in U251 cells cultured with ALS-CSF had the same trend.Conclusion: ALS-CSF could induce the generation of TNTs-like structure in U251 cells,and the ALS-related pathogenic protein may propagate through TNTs-like structure in central nervous system of patients with ALS.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.006

#通信作者，男，1960年11月生，博士，教授，主任医师，研究方向:神经退行性疾病，E-mail:13838210077@163.com

中图分类号R741.02

*国家自然科学基金资助项目81471307，81301086，81100881，81100949；郑州市科技领军人才项目13IPLJRC675