刘　佳，赵小学，李红萍，程学敏，巴　月，李庆波，丁记者，朱静媛#，赵宗生#

1)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 450001　2)济源市重金属监测与污染治理重点实验室 济源 459000

河南某工厂附近农田土壤中抗生素抗性基因与可移动遗传元件的分布>*

刘佳1)，赵小学2)，李红萍1)，程学敏1)，巴月1)，李庆波1)，丁记者1)，朱静媛1)#，赵宗生2)#

1)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 4500012)济源市重金属监测与污染治理重点实验室 济源 459000

关键词农田土壤；抗生素抗性基因；可移动遗传元件；河南省；水平基因转移

摘要目的：观察河南某工厂附近农田土壤中抗生素抗性基因和可移动遗传元件的分布。方法：分别于不同时间点采集河南某工厂主导风向下风向上距离为700～2 500 m不等的7块农田土壤的土样，提取总DNA，采用PCR法检测15种抗生素抗性基因(包括四环素类药物抗性基因tetA、tetC、tetE、tetM、tetQ、tetW，磺胺类药物抗性基因sulⅠ、sulⅡ，β内酰胺类药物抗性基因bla-TEM、SHV、CTX-M-1，喹诺酮类药物的抗性基因qnrA、qnrB、qnrS，链霉素类药物抗性基因strA)和4种可移动遗传元件(包括整合酶基因intI1、intI2，插入序列共同区基因orf513、ISCR2)，PCR阳性产物送测序，通过BLAST与GenBank数据库进行同源性比对。结果：共检出8种抗生素抗性基因，分别是sulⅡ、tetC、bla-TEM、sulⅠ、tetA、strA、tetM和tetW；3种可移动遗传元件intI1、intI2、ISCR2。各PCR扩增阳性产物经测序比对后，与GenBank已有序列识别度为95%～100%。各基因在不同距离土样中的阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)，sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1在不同时间点的土样中阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：该工厂附近农田土壤中常见抗生素抗性基因及可移动基因元件为sulⅡ、tetC、bla-TEM、sulⅠ和intI1，除sulⅠ外，sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1的分布均具有时间差异，但在不同距离农田土壤中分布稳定。

2006年，Pruden等[1]提出将抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作为一种新型的环境污染物。携带ARGs的土壤微生物是环境中ARGs的主要贮存库之一[2]，被称为土壤抗生素抗性组。通过基因的水平转移(lateral/horizontal gene transfer, L/H GT)，ARGs可能在环境微生物和临床病原体之间进行转移、交换，给人类健康带来巨大的威胁。可移动遗传单元(mobile genetic elements, MGEs)包括质粒、转座子、插入序列等，是各种ARGs在不同微生物之间进行基因转移、扩散的工具。现有研究[3-4]大多集中在畜禽养殖场及其周边环境、受污染河流及其底泥中ARGs的检测，对普通农田土壤中ARGs及MGEs的分布研究较少。研究[5]表明，新鲜农产品上可以检测出抗生素抗性菌和不同的ARGs；农田新鲜蔬菜和超市蔬菜上检出细菌的抗生素抗性不同[6]；施肥对土壤及蔬菜上抗生素抗性细菌、ARGs的分布有明显影响[7]。该研究在不同时间点对距河南某工厂不同距离的农田土壤中的ARGs及MGEs进行检测，尝试分析其空间、时间分布规律。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器Soil DNA 提取试剂盒(OMEGA公司)，2×Taq PCR Master Mix(康为世纪生物科技有限公司)，Lab Cycler PCR仪(德国圣欧国际有限公司)，DYY-6型电泳仪(北京六一仪器厂)，Gene Genius凝胶成像系统(Gene公司)，超微量分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo公司)。

1.2土壤样品采集按照《土壤环境监测技术规范》(HJ/T 166-2004)，于2014年3月(t1)、6月(t2)、10月(t3)和2015年1月(t4)，在河南省某地某有色金属、贵金属冶炼加工厂常年主导风向的下风向，根据距离烟囱的位置由近及远选择7块农田土壤，距离分别约为700、900、1 500、1 600、1 700、2 100、2 500 m，分别编号为G1～7号采样区。在每个采样区采用梅花点布点法分别采集5个点的土样，去除土壤表面杂质，采样锨垂直入土，采集深度15～20 cm，采取表层土样约1 kg，将5个点的土样在牛皮纸上均匀混合，采用四分法取得混合土样，用高压灭菌的EP管收集混合土样约100 g以备DNA提取，同时做好采样记录和采样标记。

1.3土壤样本总DNA的提取及ARGs、MGEs检测采用优化的脱腐方案[8]对土样进行预处理后，用Soil DNA提取试剂盒提取土壤样本的总DNA，用超微量分光光度计检测含量以及纯度，确定总DNA提取质量。PCR检测15种ARGs，包括四环素类药物抗性基因tetA、tetC、tetE、tetM、tetQ、tetW，磺胺类药物抗性基因sulⅠ、sulⅡ，β内酰胺类药物抗性基因bla-TEM、SHV、CTX-M-1，喹诺酮类药物抗性基因qnrA、qnrB、qnrS，链霉素类药物抗性基因strA；4种MGEs，包括整合酶基因intI1、intI2，插入序列共同区基因orf513、ISCR2。引物序列见表1。PCR反应总体系25 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，终浓度0.25 μmol/L的上、下游引物共2.5 μL，模板DNA 1 μL， ddH2O 9 μL。扩增条件：94 ℃ 预变性5 min;94 ℃变性50 s，50 ℃退火50 s, 72 ℃延伸50 s，30个循环;72 ℃充分延伸10 min。取5 μL扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳检测。PCR阳性产物送铂尚生物公司测序，测序结果与GenBank数据库进行BLAST同源性比对。

表1　PCR扩增引物序列信息

1.4统计学处理采用SPSS 21.0进行分析，不同时间点、不同采样点土样上述基因阳性率的比较采用Fisher精确概率法，检验水准α=0.05。

2结果

2.1PCR检测及测序分析结果经PCR共检测出8种ARGs、3种MGEs阳性，见图1。8种ARGs的阳性率分别是sulⅡ(22/28，78.6%)、tetC(22/28，78.6%)、bla-TEM(18/28，64.3%)、sulⅠ(15/28，53.6%)、tetA(11/28，39.3%)、strA(9/28，32.1%)、tetM(6/28，21.4%)和tetW(3/28，10.7%)。3种MGEs的阳性率分别是intI1(18/28，64.3%)、intI2(3/28，10.7%)和ISCR2(7/28，25.0%)。将测序结果与GenBank数据库中已发表的序列进行BLAST序列比对，发现其序列与广泛分布于环境的条件致病菌(嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌)，动物致病菌(猪链球菌)，环境中不可培养微生物以及临床常见致病菌(大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌)具有高度同源性，识别度达95%～100%。测序后序列上传GenBank，登录号分别为KT625465、KT625466、KT625467、KT625468、KT625469、KT625470、KT625471、KT625472、KU940035、KU940036、KU940037。

M：Marker；1：sulⅡ；2：ISCR2；3：tetC；4：tetM；5：tetW；6：sulⅠ；7：intI1；8：intI2；9：bla-TEM；10：tetA；11：strA。图1　PCR扩增的ARGs和MGEs阳性产物的电泳结果

2.2不同时间点、不同采样点土样中ARGs和MGEs的分布各土壤样本不同时间点所检测的ARGs和MGEs阳性基因谱见表2。检测阳性的各基因在不同距离土样中的阳性率差异均无统计学意义，见表3。检测阳性的各基因在不同时间点的分布情况见表4，由表4可知，sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1在不同时间点的土样中检出阳性率差异有统计学意义。

表2　不同采样点4个时间点检测ARGs和MGEs阳性基因谱(总数)

表3　不同采样点ARGs

表4　不同时间点ARGs

3讨论

ARGs的分布与播散与MGEs的存在紧密相关，因此该研究对土壤样本中的ARGs及MGEs都做了检测。该研究选择检测的15种ARGs包括了临床和养殖兽药中较早使用而且消费量较高的几种抗生素抗性基因，如针对磺胺类抗生素、四环素类抗生素和β-内酰胺类抗生素抗性基因sulⅠ、sulⅡ、tetA、tetM、tetW、tetC、bla-TEM等。结果发现这几种抗生素的ARGs检测阳性率较高，分别是sulⅡ(78.6%)、tetC(78.6%)、bla-TEM(64.3%)和sulⅠ(53.6%)。

四环素类抗生素是目前世界上用量最大、使用最广泛的抗生素种类之一，除了很早就在临床使用，还作为兽药和促生长剂大量用于畜禽养殖业和水产养殖业等，因此在环境特别是土壤环境中的残留情况令人瞩目。海边渔场的底泥中[9]、废水处理厂的入厂水与出厂水中[10]、养猪场附近的农田土壤中[11]等都曾发现此类ARGs高丰度的分布，提示与四环素类抗生素的环境污染和残留紧密相关。该研究中7块土壤的混合样本中都检测出tetC，tetA、tetM、tetW也有不同程度的检出，与以上研究结果相符。

与四环素类抗生素一样，磺胺类ARGs经常被检测到且检出频率非常高，二者均已经被证实广泛分布于粪便、废水以及粪便施肥的土壤中和废水处理厂等环境中[10,12]。该研究中sulⅡ在7块土壤的混合样本中的检出率与tetC一样最高，为78.6%，与以往的研究结果一致。

bla-TEM作为编码β-内酰胺类抗生素抗性的基因，是最广为人知的一类ARGs，从20世纪60年代至今在临床已发现170多种变异，近年来有被CTX-M型取代为主要流行型的趋势。关于bla-TEM分布的研究[10]主要集中于临床分离致病菌(如大肠埃希菌)的耐药性研究，在环境中的分布主要见于废水处理厂，在农田土壤中的研究报道少见，而在该研究中7块土壤的混合样本中都检测出bla-TEM，提示这种临床常见ARGs可能通过L/H GT进入了土壤自然环境中，这也与该研究中发现的多个MGEs检出阳性的结果相符。

IntI1、intI2、ISCRs是常见的可能参与L/H GT的一类MGEs。有研究[13-14]表明intI1、intI2在肉鸡养殖场的土壤样本中与多种ARGs的分布呈现一致性，其丰度又与土壤样本中抗生素含量、某些金属含量等正相关；而在农药污染的土壤样本中也发现有intI1、intI2的存在，提示ARGs及MGEs的分布可能是多种环境因素共同选择的结果。目前ISCR1(即orf513)和ISCR2是临床分离多重耐药致病菌的研究热点，但在自然环境中的检测不多。该研究检测出了intI1(64.3%)、intI2(10.7%)和ISCR2(25.0%)3种基因，提示多种MGEs共存影响土壤环境中ARGs的分布。

综上所述，该工厂附近农田土壤中常见ARGs及MGEs为sulⅡ、tetC、bla-TEM、sulⅠ和intI1，除sulⅠ外，sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1分布具有时间差异，但不同距离农田土壤中各基因的阳性率和种类分布稳定。同时该研究发现sulⅡ和intI1、tetC和bla-TEM存在相似的时间分布趋势，提示它们具有相似的来源或传播途径，下一步可通过基因定量研究探索。此外，对测序结果的BLAST比对分析发现，土壤环境中ARGs及MGEs分布和来源复杂，如何预防及控制ARGs的分布和扩散尚需更多的研究。

参考文献

[1]PRUDEN A,PEI R,STORTEBOOM H,et al.Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: studies in northern Colorado[J].Environ Sci Technol,2006,40(23):7445

[2]SU JQ,WEI B,XU CY,et al.Functional metagenomic characterization of antibiotic resistance genes in agricultural soils from China[J].Environ Int,2014,65:9

[3]KRISTIANSSON E,FICK J,JANZON A,et al.Pyrosequencing of antibiotic-contaminated river sediments reveals high levels of resistance and gene transfer elements[J].PLoS One,2011,6(2):e17038

[4]ZHANG T,ZHANG XX,YE L.Plasmid metagenome reveals high levels of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in activated sludge[J].PLoS One,2011,6(10):e26041

[5]BLAAK H,VAN HOEK AH,VEENMAN C,et al.Extended spectrum β-lactamase- and constitutively AmpC-producing Enterobacteriaceae on fresh produce and in the agricultural environment[J].Int J Food Microbiol,2014,168-169:8

[6]SCHWAIGER K,HELMKE K,HÖLZEL CS,et al.Antibiotic resistance in bacteria isolated from vegetables with regards to the marketing stage(farm vs. supermarket)[J].Int J Food Microbiol,2011,148(3):191

[7]MARTI R,SCOTT A,TIEN YC,et al.Impact of manure fertilization on the abundance of antibiotic-resistant bacteria and frequency of detection of antibiotic resistance genes in soil and on vegetables at harvest[J].Appl Environ Microbiol,2013,79(18):5701

[8]席峰,傅莲英,王桂忠,等.海洋沉积物DNA提取前的简易脱腐方法研究[J].高技术通讯,2006,16(5):539

[9]TAMMINEN M,KARKMAN A,LHMUS A,et al.Tetracycline resistance genes persist at aquaculture farms in the absence of selection pressure[J].Environ Sci Technol,2011,45(2):386

[10]LAHT M,KARKMAN A,VOOLAID V,et al.Abundances of tetracycline, sulphonamide and beta-lactam antibiotic resistance genes in conventional wastewater treatment plants(WWTPs) with different waste load[J].PLoS One,2014,9(8):e103705

[11]WU N,QIAO M,ZHANG B,et al.Abundance and diversity of tetracycline resistance genes in soils adjacent to representative swine feedlots in China[J].Environ Sci Technol,2010,44(18):6933

[12]GAO P,MUNIR M,XAGORARAKI I.Correlation of tetracycline and sulfonamide antibiotics with corresponding resistance genes and resistant bacteria in a conventional municipal wastewater treatment plant[J].Sci Total Environ,2012,421/422:173

[13]HE LY,LIU YS,SU HC,et al.Dissemination of antibiotic resistance genes in representative broiler feedlots environments: identification of indicator ARGs and correlations with environmental variables[J].Environ Sci Technol,2014,48(22):13120

[14]DEALTRY S,HOLMSGAARD PN,DUNON V,et al.Shifts in abundance and diversity of mobile genetic elements after the introduction of diverse pesticides into an on-farm biopurification system over the course of a year[J].Appl Environ Microbiol,2014,80(13):4012

(2015-09-02收稿责任编辑徐春燕)

Prevalence of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in farmland soil near a factory of a certain city in Henan Province

LIUJia1),ZHAOXiaoxue2),LIHongping1),CHENGXuemin1),BAYue1),LIQingbo1),DINGJizhe1),ZHUJingyuan1),ZHAOZongsheng2)

1)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)JiyuanCityKeyLaboratoryofHeavy-MentalMonitoringandPollutionControl,Jiyuan459000

Key wordsfarmland soil;antibiotic resistance gene;mobile genetic element;Henan Province;lateral/horizontal gene transfer

AbstractAim: To investigate the prevalence of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in farmland soil near a factory of a certain city in Henan Province.Methods: Mixed soil samples of 7 pieces of farmland with different distance(700-2 500 m) from a factory at different time points in Henan Province were collected and total DNA was extracted by DNA extraction kit. Fifteen kinds of antibiotic resistance genes and 4 kinds of mobile genetic elements were detected by PCR，which included tetracycline resistance genes(tetA,tetC,tetE,tetM,tetQ,tetW),sulfonamides resistance genes(sulⅠ,sulⅡ), β-lactam resistance genes(bla-TEM,SHV,CTX-M-1), quinolones resistance genes(qnrA,qnrB,qnrS), streptomycin resistance gene(strA), class 1 and class 2 integron genes(intⅠ1,intⅠ2), and insertion sequence common region genes(orf513,ISCR2). Positive products of PCR were sequenced and compared with sequences in GenBank database by BLAST software.Results: Eight antibiotic resistance genes were found positive including sulⅡ, tetC, bla-TEM, sulⅠ, tetA, strA, tetM and tetW. Mobile genetic elements intI1, intI2, and ISCR2 were positive in 7 pieces of farmland. All sequences identified had greater than 95% homology with genes in GenBank by BLAST software. Genes positive rates from different soil samples were not found significantly different(P>0.05), however, positive rates of sulⅡ, tetC, bla-TEMand intI1 in different time points were significantly different(P<0.05).Conclusion: Antibiotic resistance genes and mobile genetic elements sulⅡ, tetC, bla-TEM，intI1 and sulⅠ are found common in farmland near the factory. The distributions of sulⅡ, tetC, bla-TEMand intI1 except sulⅠ may vary with time and stabilize in the soil with different distance to the factory.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.004

#通信作者：朱静媛，女，1976年11月生，博士，副教授，研究方向：环境相关疾病及生物标志，E-mail:yuanzhu@zzu.edu.cn；赵宗生，男，1971年11月生，本科，工程师，研究方向：环境监测，E-mail:hnjyhbzs818@sina.com

中图分类号R124

*国家自然科学基金青年科学基金资助项目81202174