周 奇，马春玲，王国英

(1.青岛大学医学院，山东青岛 266021;2.临沂市妇女儿童医院，山东临沂 276002)

·论 著·

山东地区健康人群腺病毒稀有血清型感染状况调查分析

周 奇1，2，马春玲2，王国英1△

(1.青岛大学医学院，山东青岛 266021;2.临沂市妇女儿童医院，山东临沂 276002)

目的 调查山东地区健康人群中腺病毒不同血清型的感染状况，筛选出流行水平较低的腺病毒血清型，用于腺病毒载体构建。方法 利用腺病毒不同血清型标准株，以ELISA方法检测健康人群中不同腺病毒血清型的中和抗体。结果 山东地区18～70岁的健康人群中腺病毒总抗体的阳性率为95.2%。其中Adv3、Adv5、Adv7、Adv11、Adv26、Adv35、Adv48、Adv49中和抗体的阳性率分别为：69.8%、71.0%、61.0%、9.4%、2.2%、5.8%、0.8%、1.6%。Adv11、26、35、48、49 5个血清型的阳性率远低于Adv3、5、7型(P<0.01)。结论 山东地区腺病毒的总感染率较高，不同血清型之间有显著差异，其中Adv26、48、49型腺病毒感染率较低，可用于腺病毒载体的构建。

腺病毒; 载体; 血清型; 中和抗体; ELISA

腺病毒是1953年由Rowe等[1]从小儿扁桃体的细胞培养中发现的，对其生物学和免疫学特征人类已经有了比较全面的认识[2-3]。腺病毒自然感染非常普遍，部分血清型可引起爆发，但对免疫功能正常的人来说常自限性恢复，所以腺病毒的总体致病性相对较弱[4]。另外它可以感染很多分裂期或静止期细胞，即使在一些高度分化的组织细胞中也可增殖。因此，修饰的腺病毒于上世纪80年代开始被用作哺乳动物细胞的转基因载体。由于腺病毒载体具有宿主范围广、包装容量大、转染效率高、安全性好等突出的优势，它已经成为继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统[5]。目前使用的腺病毒载体多以5型腺病毒血清型的基因组为框架进行构建的，但是人群中普遍存在着5型腺病毒的中和抗体，研究证明中和抗体的存在是影响目的基因表达的一个重要因素，从而限制了腺病毒载体的广泛应用[6]。对健康人群中不同腺病毒血清型的中和抗体进行检测，统计分析不同血清型的中和抗体在人群中的存在情况，从中筛选出流行水平较低的稀有血清型，利用其基因组进行载体构建，可以减少现存中和抗体的免疫影响，有利于目的基因的表达。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从山东省临沂市、青岛市、济南市、菏泽市、威海市5个地区收集到健康体检者的血清标本500例，均获得知情同意。年龄为18～70岁，平均36岁，其中男242例，女258例。

1.2 主要毒株、细胞和试剂：腺病毒1～49型国际标准毒株购于北京302医院病毒研究室；A549细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所；德国维润腺病毒总抗体检测试剂盒购于广州市益满生物科技有限公司。

1.3 血清标本的收集与制备 每个研究对象均采集空腹静脉血5 mL，血液标本常温放置30 min后，3 000 r/min离心10 min，收集血清1.5 mL转移至EP管中,置于-20 ℃备用。

1.4 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型病毒的扩增、提纯与滴度测定 首先对冻存的A549细胞进行复苏并传代；取上述血清型的腺病毒感染A549细胞进行病毒扩增；扩增后通过氯化铯梯度离心法进行纯化；最后以Karber法计算病毒滴度。

1.5 血清腺病毒总抗体的检测 利用德国维润腺病毒IgG抗体检测试剂盒，严格按照试剂说明书进行操作，对500例正常血清进行原倍检测，从中筛选出腺病毒感染阳性的血清标本。

1.6 血清中和抗体效价的测定 A549细胞以5×103个细胞/孔加入96孔板中，37℃，5%CO2培养，抽取随机血清标本20份，用PBS等比稀释，与同体积MOI=20的各血清型病毒原液混合后加入96孔板中，设细胞、病毒对照，培养3 d后观察细胞生长状态，在病毒对照出现70%以上的病变时判断结果，以完全抑制细胞病变的最大稀释倍数做为中和抗体的效价。

1.7 用ELISA方法检测血清中Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒的中和抗体的阳性率 用包被缓冲液将各病毒原液稀释至2×106pfu/mL加入到96微孔板中，每孔加100 μL，4 ℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检血清、阴性血清、阳性对照100 μL于上述已包被之反应孔中，置37 ℃孵育1 h，洗涤，加入新鲜稀释的酶标二抗100 μL，37 ℃孵育1 h，洗涤，加入底物100 μL，37 ℃孵育30 min，加入终止液50 μL，用酶标仪读取试验结果。

1.8 阳性结果判断 使用阴性血清测定结果均值的2倍作为阳性判断值。

1.9 统计学处理 应用SPSS19.0软件进行统计学分析和数据处理，以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。

2 结 果

2.1 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒扩增的结果 加入各型腺病毒原液50 μL感染A549细胞，3 d以后细胞开始出现病变，与正常细胞对照组相比典型的CPE为：细胞肿胀、变圆、脱落。分别选取一个正常细胞对照和一个典型CPE进行拍照，结果见图1。

A表示未感染腺病毒Ad35的A549细胞;B表示感染腺病毒Ad35的A549细胞。

图1 A549细胞的形态

2.2 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒滴度的检测结果 通过系列倍比稀释的病毒液感染96孔板中的A549细胞，10 d后计数CPE出现的孔数，按公式Titre(pfu/mL)=10(x+0.8)测得病毒滴度分别为:Ad3=1.2×109pfu/mL,Ad5=1.9×109pfu/mL,Ad7=1.1×109pfu/mL,Ad11=1.5×109pfu/mL,Ad26=2.0×109pfu/mL,Ad35=0.6×109pfu/mL,Ad48=2.2×109pfu/mL,Ad49=1.8×109pfu/mL。

2.3 血清腺病毒总抗体阳性率 对500例血清进行总抗体检测，只有24例标本为阴性，阳性率为95.2%，对阳性血清再进行中和抗体的检测，见图2。

2.4 血清中和抗体效价的检测 血清中和抗体效价试验结果见表1，随机抽选的20例血清标本中，Ad35、48、49均没有检测到相应的中和抗体，Ad3的效价在1∶8稀释倍数后有所下降，其他血清型的中和抗体效价均在1∶4的稀释倍数后开始有所下降，因此选择1∶4作为血清的稀释倍数，见表1。

2.5 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒中和抗体的ELISA检测结果 从以上结果可以看出Ad3、Ad5、Ad7血清型阳性率均在60%以上，其余5个型别的腺病毒的流行水平较低，均低于10%。其中Ad11型阳性率最高为9.40%，其次是Ad35型阳性率5.8%，Ad26型阳性率2.2%，Ad49型阳性率1.6%，Ad48型阳性率最低为0.8%。Ad3、Ad5、Ad7血清型的阳性率与Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49血清型比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表1 各型腺病毒的中和抗体的效价

表2 各型腺病毒的中和抗体的阳性率

图2 各型腺病毒中和抗体阳性率比较

3 讨 论

至20世纪80年代腺病毒基因组用于载体的构建以来，腺病毒载体在基因诊断和疫苗应用上得到了广泛应用[5]，但是腺病毒载体还存在着缺乏靶向性、目的基因表达持续时间较短、外源基因表达的可控性差等问题，对腺病毒载体进行优化是研究者们研究的热点。

目的基因表达持续时间普遍认为与机体的免疫反应有关。国外有研究小组将表达荧光素酶包被基因重组的Ad35型腺病毒载体注射到有5-型腺病毒型免疫力小鼠体内[6]，明显地检测到荧光素酶的表达；而用荧光素酶包被基因重组的5-型腺病毒型载体感染同样有5-型腺病毒型免疫力小鼠，此包被基因的表达活性较没有5-型腺病毒型免疫力的对照小鼠下降90%。这说明避开现存的腺病毒中和抗体的影响可提高目的基因的表达活性。

腺病毒各血清型的分布存在一定地区和人种的差异，对山东地区健康人群进行腺病毒各血清型中和抗体的检测，有利于了解山东地区健康人群中腺病毒中和抗体的存在情况，对避开现存中和抗体构建新型腺病毒载体打下研究基础[7-9]。

本研究证明在我国山东地区的健康人群中，腺病毒不同血清型中和抗体的阳性率有着显著差异，其中Ad5的中和抗体阳性率最高，对5型腺病毒载体的临床应用会造成一定影响。Ad11、Ad35、Ad26、Ad49、Ad48型的中和抗体阳性率较低，均在10%以下。利用阳性率最低的Ad26、Ad49、Ad48三型腺病毒构建载体相对于Ad5型来说可有效避开健康人群中腺病毒现存免疫力的影响，有利于目的基因的表达。

[1]RoweWP,HuebnerRJ,GilmoreLK,etal.Isolation

of a cytopathic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture[J].Soc Bio Med,1953,84(3):570-573.

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Investigation and analysis on infection situation of rare adenovirus serotype among normal population in Shandong area

ZhouQi1,2,MaChunling2,WangGuoying1△

(1.MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266021,China;2.LinyiMunicipalWomenandChildren′sHospital,Linyi,Shandong276002,China)

Objective To investigate the infection status of different adenovirus serotypes of adenovirus among normal population in Shandong area in order to screen out the serotypes of low prevalence level for the use in the adenoviral vector construction.Methods Serum levels of neutralizing antibodies against different serotypes of adenovirus were determined with ELISA by using different adenovirus serotype standard strains.Results The positive rate of total adenovirus antibodies in the normal population aged 18-70 years old in Shandong area was 95.2%,in which the antibody positive rates of Adv3,Adv5,Adv7,Adv11,Adv26,Adv35,Adv48 and Adv49 were 69.8%,71.0%,61.0%,9.4%,2.2%,5.8%,0.8% and 1.6%,respectively.The positive rates of Adv11,26,35,48,49 neutralizing antibodies were significantly lower than those of Adv3,5,7 serotypes(P<0.01).Conclusion The adenovirus total infection rate is high in Shandong area.The infection rates of different serotypes are different,in which Adv26,48,49 serotypes have lower infection rates and can be used for constructing the adenovirus vector.

adenovirus; vector; serotype; neutralizing antibodies; ELISA

周奇，男，主管检验技师，主要从事病毒免疫学研究。△通讯作者，E-mail:bbq999@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.021 文献标识码：A 文章编号：1673-4130(2016)07-0923-03

2015-10-20)