肖　锋　张晓伟　张　杰　胡建功

( 泰山医学院附属医院，山东 泰安　271000 )



Gli-1蛋白在食管鳞癌组织的表达及其临床意义*

肖锋张晓伟张杰胡建功

( 泰山医学院附属医院，山东 泰安271000 )

摘要：目的检测食管鳞癌及其癌旁组织和食管正常组织的中Gli-1的表达水平，并探究其与食管鳞癌的临床及病理因素之间的关系。方法免疫组化法测36例食管癌及其癌旁组织和9例食管正常组织Gli-1表达水平。结果Gli-1在食管鳞癌阳性表达率为55.6%；癌旁为13.9%；食管正常组织中为11.1%；组间差异有统计学意义(P< 0.05)； Gli-1在癌旁和正常组织中均显著低于鳞癌(P< 0.05)；Gli-1在癌旁和正常食管中表达差异无统计学意义(P>0.0 5)。其阳性表达率在Ⅰ~Ⅱ期远低于Ⅲ~Ⅳ期(P< 0.05)，T1~T2远低于T3~T4 (P< 0.05)，无淋巴转移的远低于转移( P< 0.05)。但其表达与年龄、性别、肿瘤位置、直径及分化程度无关(P>0.05)。结论Gli-1参与了食管鳞癌的发展进程，高表达的Gli-1可能是促进食管鳞癌浸润转移的因素之一。

关键词：HH信号；食管鳞状细胞癌；Gli-1蛋白；免疫组化

当前，食管癌(esophageal carcinoma，EC)在世界上较为常见。仅2008年，就有超过484000例患者被诊断为食管癌[1]。食管癌在全球范围内恶性肿瘤引起死亡的主要原因中占第六位，并且其发病率正迅速增加[2]。我国常见的组织类型是食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。食管癌的早期诊断率低，死亡率极高。当前，已经证实Hedgehog(HH)信号通路是在胚胎发育的过程中对于细胞的生长、增值、生存和分化起到关键的作用，此通路与很多肿瘤的发生、发展(包括侵袭和转移)密切相关[3]。本实验用免疫组化法检测HH通路中的Gli-1蛋白在ESCC及癌旁组织和正常食管组织中表达水平，探讨其与ESCC发生发展的关系，以期为ESCC的临床诊断及其治疗提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1材料及试剂

收集我院胸外科2012年11月~2013年11月手术切除的食管鳞癌(ESCC)及与其对应的癌旁组织(距癌灶5 cm以上)各36例，另胃镜下取正常食管组织9例。全部患者均经病理证实为食管鳞癌，癌旁组织为非癌组织，术前未经放化疗及其他免疫治疗，亦无其他部位的肿瘤。患者年龄在40~76岁，≥55岁有26例，<55岁有10例；男20例，女16例；肿瘤直径≤3 cm 有21例，>3 cm 有15 例；中高分化29例，低分化7例；中下段癌30例，上段癌6例；按2002年制定的第六版TNM标准进行分类[4]：Ⅰ和Ⅱ期共13例，Ⅲ和 Ⅳ期共23例；T1和T2期共16例，T3和T4期共20例；淋巴转移21例，无淋巴转移15例。所有的实验标本均经先经过10%的甲醛固定，后经石蜡包埋，切片本实验采用的厚度为5 μm，用来做HE和免疫组化。兔抗人Gli-1多克隆抗体(Gli-1，sc-20687)购买于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司，即用型免疫组化EliVisionTMsuper试剂盒(鼠/兔)购买于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2方法

严格按照即用型免疫组化EliVisionTMsuper试剂盒(鼠/兔)(试剂A为放大剂，试剂B为多聚酶结合物)说明书进行。切片脱蜡及水化，高温高压修复，依次加Gli-1抗体(1∶100)、试剂A、试剂B、 新鲜配制的DAB， 经苏木精复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗，碳酸锂返蓝，梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固，显微镜下观察结果。用已知阳性切片为阳性对照， PBS 代替Gli-1抗体为空白对照。

1.3结果判定

参照Yoshikawa等[5]方法①由两名病理科专家在不知其临床病理特征下，显微镜观察细胞数。②把胞核和(或)胞浆中黄或棕黄色颗粒细胞视为阳性染色。③基于特定的百分比肿瘤细胞染色：无阳性反应或阳性染色< 5%为(-),≥5%而<35%为(+),≥35%而< 65%为(++),≥65%则(+++)。而本实验采取了适当修改。定义阳性反应或阳性染色< 5%为阴性表达，≥5%统称为阳性表达。

1.4统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,计数资料采用χ2检验，当P<0.05时为差异有显著性。

2结果

2.1Gli-1蛋白在食管癌组织、癌旁组织及食管正常组织的的表达

Gli-1蛋白主要在胞核/胞浆中表达。其阳性表达率在食管鳞癌组织为55.6%(20/36) (表1) ；癌旁组织为13.9%(5/36) (表1)；正常食管粘膜组织为11.1% (1/9)(表1)。组间差异有统计学意义(χ2=16.384,P<0.05，表1)。癌旁组织和正常粘膜组织显著低于食管鳞癌(P<0.05，表1)；癌旁组织与正常粘膜组织间的表达差异无统计学意义(P>0.05，表1) 。

表1　Gli-1在食管癌组织、癌旁组织及食管正常组织的表达

2.2食管鳞癌(ESCC)中Gli-1的表达与临床及病理特征之间的关系

由表2得知其表达与年龄、性别、分化程度、肿瘤直径和位置无关(P>0.05)。其阳性表达率在Ⅰ和Ⅱ期显著低于Ⅲ和Ⅳ期(P<0.05)；在T1和T2期显著低于T3和T4期(P<0.05)；无淋巴转移者显著低于转移者(P<0.05)。当P<0.05，差异有统计学意义。

表2　食管鳞癌组织中Gli-1蛋白的表达

3讨论

到目前为止，食管癌的发生机制没有完全被阐明，但是越来越的研究表明食管癌的形成是一多涉及众多方面因素的过程，其中也涉及了信号通路等方面的问题。近几年来研究较多的HH信号通路(Shh等Hh配体蛋白、Ptch等跨膜蛋白、Gli-1等下游转录因子)发现在不少肿瘤中被激活。其中一种常见的激活方式是Shh或者Hh配体与Ptch1或者Ptch2受体结合，诱导Smo基因的激活，接着下游转录因子Gli-1等的激活。其Gli蛋白在此通路中是很重要的蛋白，不但反映HH通路的活化，而且与基因的转录密切相关，其作用可谓是承上启下。

Ma X等[6]发现在食管癌中Gli-1的表达是增高的，暗示HH信号在食管癌中普遍激活。Mori Y等[7]用不同的办法对食管鳞癌中Gli-1水平检测，RT-PCR揭示在34种细胞株中超过百分之九十存在其表达；免疫组化揭示有一半人ESCC标本Gli-1呈阳性表达，其阳性表达在无淋巴转移和T1~T2期明显低于淋巴结转移和T3~T4期，其表达与癌的位置及分化度无关；亦发现其越高表达，患者预后就越差。Yanai K等[8]发现Gli-1的表达水平与胃癌淋巴结转移有关，一种HH信号的抑制剂—环杷明在体内或者体外都能抑制胃癌细胞的成长，这从侧面证明了HH信号与胃癌的发生关系密切。Jeng W J等[9]对手术后肝细胞癌Gli进行研究，RT-PCR结果示Gli-1mRNA在50例中全表达，其表达与肿瘤的大小及TNM分期有关，亦其越高表达，总的存活时间越差。Ding Y等[10]对结肠癌中Gli-1进行检测，结果示79.2%的结肠癌中存在高表达，其表达与淋巴的转移和T分期有关，亦揭示其高表达提示不良的预后。

Gli-1在消化系肿瘤存在不同程度表达上调，反映了HH信号通路的激活在肿瘤的发生及发展中是较为普遍的，同时我们也发现Gli-1的异常的表达与肿瘤的浸润转移相关。本实验发现了Gli-1在癌旁组织和正常粘膜组织的表达低于食管鳞癌；亦发现其表达与食管鳞癌的临床分期和T期有关，且随着分期的增高，其表达也升高，揭示其参与了食管鳞癌的浸润生长；本实验亦揭示其表达与淋巴结转移有关，其表达越高，越易发生转移。同时暗示在Gli-1蛋白表达越高，肿瘤具有的侵袭能力就相对的越强，预后就相对较差。使得检测Gli-1蛋白在食管鳞癌(ESCC)中的表达来判断患者的预后的程度提供了一定的理论依据。

综上所述， Gli-1参与了食管鳞癌的发生发展，与肿瘤浸润转移有关；检测其在食管鳞癌的表达可有助于判断其恶性程度，也可为临床的诊断及其治疗提供一定的理论参考依据。

参考文献：

[1]Wheeler J B, Reed C E. Epidemiology of esophageal cancer[J]. The Surgical clinics of North America, 2012, 92(5): 1077.

[2]Pennathur A, Gibson M K, Jobe B A, et al. Oesophageal carcinoma[J]. The Lancet, 2013, 381(9864): 400-412.

[3]Rubin L L, de Sauvage F J. Targeting the Hedgehog pathway in cancer[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2006, 5(12): 1026-1033.

[4]Sobin LH, Wittekind C (eds): TNM Classifi-cation of Malignant Tumors, ed 6[M]. New York, Wiley, 2002.

[5]Yoshikawa R, Nakano Y, Tao L, et al. Hedgehog signal activation in oesophageal cancer patients undergoing neoadjuvant chemoradiotherapy[J]. British journal of cancer, 2008, 98(10): 1670-1674.

[6]Ma X, Sheng T, Zhang Y, et al. Hedgehog signaling is activated in subsets of esophageal cancers[J]. International journal of cancer, 2006, 118(1): 139-148.

[7]Mori Y, Okumura T, Tsunoda S, et al. Gli-1 expression is associated with lymph node metastasis and tumor progression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncology, 2007, 70(5): 378-389.

[8]Yanai K, Nagai S, Wada J, et al. Hedgehog signaling pathway is a possible therapeutic target for gastric cancer[J]. Journal of surgical oncology, 2007, 95(1): 55-62.

[9]Jeng W J, Lin C C, Lin C K, et al. High Expression of Patched Homolog-1 Messenger RNA and Glioma-Associated Oncogene-1 Messenger RNA of Sonic Hedgehog Signaling Pathway Indicates a Risk of Postresection Recurrence of Hepatocellular Carcinoma[J]. Annals of surgical oncology, 2013, 20(2): 464-473.

[10]Ding Y, Zhou Y, Xiang L, et al. Expression of Glioma-associated Oncogene Homolog 1 is Associated with Invasion and Postoperative Liver Metastasis in Colon Cancer[J]. International Journal of Medical Sciences, 2012, 9(5): 334.

The expression and clinical significance of gli-1 protein in esophageal squamous cell carcinoma

XIAOFengZHANGXiao-weiZHANGJieHUJian-gong

(Affiliated Hospital of Taishan Medical College，Taian 271000，China)

Abstract:Objective: Objective To observe the expression of Gli-1 in esophageal squamous cell carcinoma ( ESCC), tumor-adjacent tissues and normal tissues ,and to investigate the expression and clinical significance of Gli-1 protein in esophageal squamous cell carcinoma. Methods： The expression of Gli-1 protein was detected by immunohistochemistry in 36 cases ESCC, tumor-adjacent tissues and 9 cases normal esophageal tissues. Results： In esophageal squamous cell carcinoma, tumor-adjacent tissues and normal tissues, the positive expression rate of Gli-1 were 55.6%，13.9%，and 11.1% respectively, there was significant difference between group ( P< 0. 05). The expression of Gli-1 protein in tumor-adjacent and normal tissues was lower than that in esophageal squamous cell carcinoma. The difference was statistically significant (P <0.05). No difference was found between tumor-adjacent and normal tissues about the expression of Gli-1 protein(P>0.05).The expression of Gli-1was not only much lower in T1~T2 than that in T3~T4 ( P< 0. 05) but also much lower in clinical stage Ⅰ~Ⅱ than that in Ⅲ~Ⅳ ( P< 0.05). The expression of Gli-1 was higher in nodal metastases group than that in group without nodal metastases ( P< 0.05). No correlations were found between Gli-1 protein and age, gender, tumor location, Tumor diameter, the degree of differentiation(P>0.05). Conclusions： Up-regulation of Gli-1 might be involved in the development of esophageal squamous cell carcinoma,and it might play a promoting role in the invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.

Key words:esophageal squamous cell carcinoma; Gli-1; immunohistochemistry

(收稿日期2015-11-10)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.02.001

中图分类号：R571

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2016)02-0121-03

通讯作者：胡建功，jghu@tsmc.edu.cn。

*作者简介：肖锋(1986—)，男，山东泰安人，住院医师，硕士，主要从事临床消化内科工作。