张平，陈晓波，廖陈曾，李万强，肖建华

(三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院泌尿外科，湖北 宜昌 443003)

环靶明联合吉非替尼对前列腺癌细胞株DU145增殖和侵袭的影响

张平，陈晓波，廖陈曾，李万强，肖建华

(三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院泌尿外科，湖北 宜昌 443003)

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组 DU145细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，融合达80%时用胰酶消化后传代，取对数生长期细胞进行实验，设空白对照组(用同体积培养基)、环靶明组、吉非替尼组和联合用药组。

1.2.2 MTT法检测细胞抑制率 细胞按5×103个/孔的密度接种于96孔板，孵育24 h后弃培养基，按分组加入相应药物(终浓度为环靶明2.5 μmol/L、吉非替尼10 μmol/L、环靶明2.5 μmol/L+吉非替尼10 μmol/L)，每组设6个复孔，作用20 h时每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h后弃培养基，加入150 μL DMSO，振荡溶解10 min后490 nm处测定各孔吸光度(A)值，抑制率=[(空白对照组A值-药物组A值)/空白对照组A值]×100%。

1.2.3 细胞侵袭实验 细胞经胰酶消化后重悬，调整密度为4×105/mL，将经过Matrigel胶包被制好的Transwell小室置入24孔板，取100 μL细胞悬液加入小室上层并按分组加入不同药物(同1.3)，每组设6个复孔，另取600 μL含10%血清的培养基加入小室下层，孵育24 h后取出，甲醇固定后0.1%结晶紫染色，浸洗后揭膜并树胶封片，随机观察6个视野(×200)，显微镜下计数平均穿膜细胞数。

1.2.4 Western blot法检测蛋白表达 将细胞悬液接种于10 cm培养皿中，按分组加入不同药物(同1.3)，培养24 h。收集细胞加入RIPA裂解液，提取总蛋白并测定蛋白浓度，取等量蛋白上样行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转PVDF膜，牛奶封闭1 h，一抗孵育4℃过夜，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后显色。取目的条带与内参照的灰度比值用作半定量分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，各组间比较采用Bonferroni t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 联合用药对DU145细胞增殖的影响 各药物处理组细胞吸光度(A)值均低于空白对照组(P＜0.01)，且联合用药组吸光度值低于环靶明(t=4.6487，P=0.001)和吉非替尼单药组(t=6.024 5，P＜0.01，见图1，表1)。环靶明、吉非替尼和联合给药组的抑制率分别为(43.16± 8.88)%、(35.97±11.26)%和(68.14±4.15)%。

表1 联合用药对DU145细胞生物学行为的影响(n=6,±s)

表1 联合用药对DU145细胞生物学行为的影响(n=6,±s)

注：与空白对照组比较，aP＜0.01；与联合用药组比较，bP＜0.01；与联合用药组比较，bP＜0.05。

组别 吸光度（A值） 穿膜细胞数（个）空白对照组吉非替尼组环靶明组联合用药组1.2103±0.1252 0.7726±0.1474ab0.6839±0.0989ab0.3842±0.0518a58.6667±8.6872 41.1667±6.3377ac39.5000±5.6480ac28.3333±3.3863a

图1 联合用药对DU145细胞增殖的影响(吸光度值，n=6)

2.2 联合用药对DU145细胞侵袭的影响 各药物处理组平均穿膜细胞数均小于空白对照组(P＜0.01)，且联合用药组平均穿膜细胞数小于环靶明组(t= 3.067 7，P=0.036)和吉非替尼单药组(t=3.525 6，P= 0.013，见图2，表1)。

图2 联合用药对DU145细胞侵袭的影响(×200，结晶紫染色，n=6)

2.3 联合用药后DU145细胞中SHH、PTCH和Gli-1蛋白表达的变化 环靶明组及联合用药组各通路蛋白的表达均低于空白对照组(P＜0.01)；吉非替尼组仅PTCH蛋白表达低于空白对照组(t=4.149 5，P=0.019)；联合用药组PTCH蛋白表达低于环靶明组(t=3.668 6，P=0.038)或吉非替尼单药组(t=4.553 9，P=0.011，见图3、表2)。

图3 联合用药对DU145细胞中Hh通路蛋白表达的影响(相对表达量，n=3)

表2 联合用药对DU145细胞中Hh通路蛋白表达的影响(相对表达量，n=3,±s)

表2 联合用药对DU145细胞中Hh通路蛋白表达的影响(相对表达量，n=3,±s)

注：与空白对照组比较，aP＜0.01；与空白对照组比较，bP＜0.05；与联合用药组比较，cP＜0.05。

组别空白对照组吉非替尼组环靶明组联合用药组SHH 0.9529±0.0979 0.9202±0.0726 0.5799±0.1080a0.5604±0.0857aPTCH 1.1112±0.1157 0.7531±0.1287bc0.6767±0.0815ac0.3601±0.0900aGil-1 0.9805±0.1147 0.9508±0.0855 0.6100±0.0879a0.5802±0.0914a

3 讨 论

前列腺癌的发病率逐年增高，因为前期症状隐匿，相当比例的患者就诊时已进展至疾病晚期。现行的综合治疗措施难以进一步提高晚期患者的生存质量并降低死亡率，探索更有效的治疗方案成为临床亟待解决的热点问题。目前针对特定信号通路的靶向药物的研究为晚期前列腺癌的治疗带来新的选择，并有望获得突破性进展。

Hedgehog信号通路和酪氨酸激酶受体通路是与人体肿瘤发生密切相关的两条主要信号通路。活化的Hh通路蛋白SHH、PTCH及Gli-1等在多种人体肿瘤中表达异常[3-4]。环靶明作为特异性的Hh通路抑制剂，可通过下调Hh通路成员的蛋白表达，阻断相应的信号传导而发挥抑癌作用[5]。肿瘤患者体内也观察到酪氨酸激酶受体通路的异常活化，以EGFR为代表的受体酪氨酸激酶在多种恶性实体瘤中过度表达[6-7]。吉非替尼作为EGFR酪氨酸激酶的高选择性拮抗剂，可通过与ATP竞争EGFR胞内区酪氨酸激酶的ATP结合位点，抑制激酶活化而发挥抗肿瘤效应[8]。

已有研究显示环靶明和吉非替尼均可抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞的生长[1-2]。由于前列腺癌的恶性进展涉及多种分子途径的异常调控，因此联合应用针对不同途径的靶向药物有可能获得协同的抗肿瘤效应，是否环靶明联合吉非替尼作用于前列腺癌可获得类似效应，目前相关的报道有限。本实验检测了两者联合作用后前列腺癌细胞生物学行为的变化，结果显示联合用药组的细胞增殖抑制率明显高于单药对照组，且联合用药较单一用药更明显地抑制了前列腺癌细胞的体外侵袭能力，结果表明环靶明联合吉非替尼作用于前列腺癌可以获得协同增强的抑癌效应。本实验进一步检测了联合用药后Hh信号通路相关蛋白的表达，结果显示联合用药组PTCH蛋白的表达明显低于单药对照组，提示联合用药通过进一步下调PTCH的表达增强了对Hh通路的抑制作用，结果也提示联合用药获得增强的抑癌效应的机制可能与吉非替尼协同环靶明下调Hh通路的PTCH蛋白表达有关。本实验为临床探索晚期前列腺癌的靶向治疗方案提供了新的思路。

[1]孙全武,周逢海,王养民,等.环巴胺对DU145细胞增殖和细胞周期的影响[J].中华男科学,2010,16(3):227-231

[2]Vicentini C,Festuccia C,Gravina GL,et al.Prostate cancer cell proliferation is strongly reduced by the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor ZD1839 in vitro on human cell lines and primary cultures[J].J Cancer Res Clin Oncol,2003,129(3):165-174.

[3]Hong Z,Bi A,Chen D,et al.Activation of hedgehog signaling pathway in human non-small cell lung cancers[J].Pathol Oncol Res, 2014,20(4):917-922.

[4]Wang YF,Chang CJ,Lin CP,et al.Expression of hedgehog signaling molecules as a prognostic indicator of oral squamous cell carcinoma [J].Head Neck,2012,34(11):1556-1561.

[5]Jeng KS,Sheen IS,Jeng WJ,et al.Blockade of the sonic hedgehog pathway effectively inhibits the growth of hepatoma in mice:An in vivo study[J].Oncol Lett,2012,4(6):1158-1162.

[6]Yu WW,Guo YM,Zhu M,et al.Clinicopathological and prognostic significance of EGFR over-expression in esophageal squamous cell carcinoma:a meta-analysis[J].Hepatogastroenterology,2011,58 (106):426-431.

[7]Arfaoui A,Kriaa L,Znaidi N,et al.Over-expression of EGFR is closely correlated to poor prognosis in Tunisian patients with non-small cell lung adenocarcinoma[J].J Immunoassay Immunochem,2014,35(3):256-268.

[8]Raymond E,Faivre S,Armand JP.Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase as a target for anticancer therapy[J].Drugs,2000,60 (Suppl 1):15-23.

2016-04-29)