严玉玲，周园红，叶红

(三峡大学第一临床医学院妇产科，湖北 宜昌 443000)

构建一种分离培养原代小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞改良方法

严玉玲，周园红，叶红

(三峡大学第一临床医学院妇产科，湖北 宜昌 443000)

目的 建立可靠稳定的小鼠肺泡Ⅱ上皮细胞(AECⅡ)的分离、原代培养技术，为进一步研究AECⅡ转分化分泌生长转化因子β1(TGF-β1)等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。方法采用传统的方法和改良后方法分别提取20只小鼠AECⅡ，将其所提取的细胞数量进行对比。结果传统组小鼠可获得(4.21±2.31)×106个，改良组小鼠可获得(13.0±2.20)×106个，差异有统计学意义(P＜0.05)，而两组小鼠在体质量、年龄以及肺组织重量方面比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论此改良方法可成功获得大量稳定的AECⅡ，为进一步研究AECⅡ转分化分泌TGF-β1等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。

小鼠肺泡Ⅱ上皮细胞；传统方法；改良方法；原代培养

肺泡Ⅱ型上皮细胞(typeⅡ alveolar epithelial cells，AEC II)是肺上皮细胞的重要组成部分，具有合成和分泌表面活性物质、参与免疫反应以及转分化等多种功能[1]。在胚胎及胎儿时期AECⅡ可增殖，但在成人期AECⅡ呈高度分化状态，正常情况下是不分裂增殖的[2]。当AECI细胞数量减少时，发现AECⅡ可转分化为肺泡Ⅰ 型上皮细胞(type I alveolar epithelial cells，AECⅠ)，整个过程可能与TGF-β1传导的信号通路有关[3]，目前还没有能完全替代AECⅡ的细胞株，为进一步研究AECⅡ转分化分泌TGF-β1等物质与转移乳腺癌休眠细胞激活相关机制，需分离纯化AECⅡ。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性昆明种小鼠体质量约20 g，共40只(三峡大学实验动物中心)。DMEM培养基、血清(GIBCO)；胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、肝素钠、Dnase I (Solarbio)；小鼠IgG(Beyotime)；红细胞裂解液(谷歌生物)；100、200目细胞筛；倒置显微镜。

1.2 方法 40只昆明种小鼠随机分为传统组与改良组，每组各20只，分别采用传统方法与改良方法分离提取并纯化AECⅡ。

1.2.1 传统方法

1.2.1.1 小鼠IgG包被培养皿 用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释小鼠IgG溶液1 mg/mL，将溶液平铺六孔板并轻晃使其完全覆盖板底(浓度0.1 mg/cm2)，于37℃培养3～4 h，吸出小鼠IgG溶液，备用[4]。

1.2.1.2 小鼠AECⅡ的分离 昆明种小鼠经腹腔注射10%水合氯醛0.2～0.3 mL，麻醉后将小鼠全身浸泡于75%酒精中(避免头部以免进入肺部)，在超净台中尽快打开小鼠的胸腔分离出气管，打开腹腔剪断腹主动脉放血，放血完成后止血钳夹闭近端气管，进行气管插管PBS 1 mL灌洗，反复3次，完整取下肺组织，调整重量约0.05 g，然后将0.25%胰蛋白酶跟Ⅰ型胶原酶各3 mL灌入肺泡腔(未能完全灌入的溶液浸泡肺组织即可)，于37℃水浴20 min，为中止消化，随即加入与消化液等体积的DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清)并混匀，尽量除去气管、血管组织、支气管，然后用剪刀将肺组织剪成1 mm×1 mm×1 mm小块(剪碎过程中加入100µL双抗)；移入50 mL离心管，向悬液加入100µL Dnase I酶，混匀后37℃水浴5 min，分别经100、200目细胞筛网过滤，800 r/min离心10 min去上清，然后用红细胞裂解液3 mL重悬细胞，室温静置5～10 min后800 r/min离心5 min去上清，用DMEM培养基5 mL重悬细胞。

1.2.1.3 小鼠AECⅡ纯化与培养 将细胞悬液接种至已包被小鼠IgG备用的孔板中，置于体积分数为5%CO2、37℃培养箱内培养1 h，吸出培养基(未贴壁的细胞)，800 r/min离心10 min后去上清，用DMEM培养基5 mL重悬细胞，细胞计数后接种于六孔板中，置于相同条件的培养箱内培养24 h后换液，在倒置显微镜下观察贴壁细胞的生长情况。

1.2.2 改良方法

1.2.2.1 小鼠IgG包被培养皿 用PBS溶液稀释小鼠IgG溶液1 mg/mL，将溶液平铺六孔板并轻晃使其完全覆盖板底(浓度0.1 mg/cm2)，于37℃培养3～4 h，吸出小鼠IgG溶液，备用[4]。

1.2.2.2 小鼠AECⅡ的分离 昆明种小鼠经腹腔注射10%水合氯醛0.2～0.3 mL，麻醉后将小鼠全身浸泡于75%酒精中(避免头部以免进入肺部)，在超净台中尽快打开小鼠的胸腔分离出气管，打开腹腔剪断腹主动脉放血，放血完成后止血钳夹闭近端气管，进行气管插管PBS 1 mL灌洗，反复3次，然后完整取下肺组织，调整重量约0.05 g，将组织浸没于预冷的PBS液中，尽量去除气管、血管组织、支气管，PBS液冲洗组织数遍后将肺组织剪成1 mm×1 mm×1 mm小块(剪碎过程加入100µL双抗)；移入50 mL离心管，分别按1:1加入0.25%胰蛋白酶跟Ⅰ型胶原酶各3 mL，枪头吹打混匀后37℃水浴震荡20 min，为中止消化，向消化好的细胞悬液中加入与消化液等量的DMEM培养基，再向悬液加入Dnase I酶100µL，用枪头充分吹打混匀后37℃水浴震荡5 min，分别经100、200目细胞筛网过滤，400×g低温离心10 min弃上清，然后用红细胞裂解液3 mL重悬细胞，室温静置5～10 min后400×g低温离心5 min弃上清，用DMEM培养基5 mL重悬细胞。

1.2.2.3 小鼠AECⅡ的纯化与培养 将细胞悬液接种至已包被小鼠IgG备用的孔板中，置于体积分数为5%CO2、37℃培养箱内培养1 h，吸出培养基(未贴壁的细胞)，800 r/min离心10 min后去上清，用DMEM培养基5 mL重悬细胞，细胞计数后接种于六孔板中，置于相同条件的培养箱内培养24 h后换液，在倒置显微镜下观察贴壁细胞的生长情况。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组小鼠一般资料比较 传统组小鼠与改良组小鼠在体质量、年龄及肺组织重量方面比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

组别传统组(n=20)改良组(n=20) t值P值体质量(g) 20.24±1.21 21.19±0.85 1.63＞0.05年龄(周) 5.18±0.40 5.66±0.68 0.89＞0.05肺组织重量(g) 0.048±0.005 0.051±0.005 2.31＞0.05

2.2 两种方法提取小鼠AECⅡ数量比较 传统组小鼠可获得(4.21±2.31)×106个，改良组小鼠可获得(13.0±2.20)×106个，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 光镜观察细胞 培养的AECⅡ约16 h贴壁，细胞呈圆形或椭圆形，24 h后逐渐聚集成岛状生长，AECⅡ胞浆丰富，核仁明显，内含大量反差明显的细小颗粒(见图1)。培养约48 h后，细胞逐渐融合成细胞单层。培养大约72 h后，细胞逐渐较前变得扁平，胞内细小颗粒明显减少。培养5～6 d后，无法辨认Ⅱ型肺泡上皮细胞。

图1 倒置显微镜下培养24 h的昆明小鼠AECⅡ细胞(×100)

3 讨 论

目前酶消化法是提取原代AECⅡ的主要方法，查阅国内外文献，常用于原代细胞消化的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶[4-5]。虽然弹性蛋白酶对AECⅡ损伤小且具有消化选择性，但因这种酶的有效作用时间有限、活性不够稳定、容易降解等问题，故本实验选择的是胰蛋白酶联合胶原酶消化法提取原代AECⅡ。

与其他原代细胞分离、培养相似，酶消化法分离AECⅡ也存在细胞聚集成团、杂细胞污染、细菌污染等问题，本实验就此做了如下改进：

在分离AECⅡ过程中，由于剪碎组织及酶对细胞的损伤会使细胞释放DNA。为防止细胞释放出来的DNA与细胞外基质形成DNA蛋白复合物，本实验采用脱氧核糖核酸酶(DnaseⅠ)来避免细胞聚集成团。

肺组织中有40多种不同的细胞。由于胰蛋白酶消化没有选择性，除AECⅡ外，还含有巨噬细胞、红细胞、成纤维细胞等杂细胞。为达到实验研究要求需将提取的AECⅡ进一步纯化。目前纯化AECⅡ的方法很多，如密度梯度离心、免疫粘附、滤膜分离、流式细胞技术。Zeng等[6]使用一种新型的微流体磁性细胞分选系统来分选肺多能干细胞，结果较为理想。本实验纯化AECⅡ的方法如下：①差速离心法去除成纤维细胞，利用AECⅡ和细胞之间的比重差异，当转速在400×g时，可使部分成纤维细胞仍悬浮于培养基而无法沉淀，从而能将部分成纤维细胞去除。传统的方法离心力转数太低，部分Ⅱ型上皮细胞无法完全沉淀，将导致细胞得率低。②免疫粘附法纯化AECⅡ，因为巨噬细胞和其他大多数非Ⅱ型细胞表面都有IgG上的Fc片段的受体，因其含有Fc片段的受体而与小鼠IgG抗体结合，吸附到板底上，不粘附的AECⅡ则不贴板底[7]。红细胞裂解液去除红细胞，虽然取肺组织之前进行了放血处理，但是AECⅡ中仍然混有红细胞，故使用红细胞裂解液裂解红细胞，但对AECⅡ并无影响。

细菌污染是原代细胞培养中普遍存在的问题。在前5次试验中，尽管采取了常规的动物消毒及无菌操作，但由于没有在剪碎组织过程中加入双抗，每次均出现细菌污染问题。为此，本实验在剪碎组织过程中加入双抗，克服了细胞被污染的难题。

此外，为进一步提高AECⅡ数量，本实验通过先剪碎组织再用酶消化(水浴震荡)方法来增加酶接触组织面积，达到充分消化的作用。Ⅱ型肺泡上皮细胞比较脆弱，在体外环境下易损伤，故整个实验过程时间最好不超过4 h，实验过程中最好使用新的剪刀，使用枪头吹打细胞时动作应轻柔，保持低温条件也是实验成功的关键[5]。

[1]Herzog EL,Brody AR,Colby TV,et al.Knowns and unknowns of the alveolus[J].Proceedings o the American Thoracic Society,2008, 5(7):778-782.

[2]Lee J,Reddy R,Barsky L,et al.Contribution of proliferation and DNA damage repair to alveolar epithelial type 2 cell recovery from hyperoxia[J].American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology,2006,290(4):L685-L694.

[3]Bhaskaran M,Kolliputi N,Wang Y,et al.Trans-differentiation of alveolar epithelial typeⅡcells to typeⅠcells involves autocrine signaling by transforming growth factor β1through the Smad pathway [J].Journal of Biological Chemistry,2007,282(6):3968-3976.

[4]郑金旭.构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(15): 2761-2762.

[5]Gonzalez RF,Dobbs LG.Isolation and culture of alveolar epithelial TypeⅠand TypeⅡcells from rat lungs[M].Second Edition.Epithelial Cell Culture Protocols,2013:145-159.

[6]Zeng L,Qiu L,Yang XT,et al.Isolation of lung multipotent stem cells using a novel microfluidic magnetic activated cell sorting system[J].Cell Biology International,2015,39(11):1348-1353.

[7]Chen J,Chen Z,Narasaraju T,et al.Isolation of highly pure alveolar epithelial typeⅠand typeⅡcells from rat lungs[J].Laboratory Investigation,2005,85(9):1181.

An improved method for the isolation and primary culture of mouse AECⅡ.

YAN Yu-ling,ZHOU Yuan-hong,YE Hong.Department of Gynaecology and Obstetrics,First School of Clinical Medicine,China Three Gorges University,Yichang 443000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo establish a reliable and stable mouse typeⅡalveolar epithelial cells(AECⅡ)isolation and primary culture technology for further study in the mechanism of trans-differentiation of AECⅡto TGF-β1and to other substances associated with the activation of dormant cells of breast cancer.MethodsThe amount of mouse AECⅡextracted from both conventional group and improved group were compared.ResultsA total of(4.21±2.31)× 106mouse AECⅡwere obtained from the conventional group,while only(13.0±2.20)×106were obtained from the improved group.The difference was statistically significant(P＜0.05).However,there were no statistically significant difference in the weight,age,and weight of the lung tissue between the conventional group and improved group(P＞0.05).ConclusionThe improved method could gain a large quantity of stableAECⅡ,which offers a foundation for further study in the mechanism of trans-differentiation of AECⅡto TGF-β1and to other substances associated with the activation of dormant cells of breast cancer.

AECⅡ;Conventional methods;Improved method;Primary culture

R-332

A

1003—6350（2016）20—3280—03

2016-03-18)

国家自然科学基金青年基金项目（编号：81402404）

叶红。E-mail：yehong998@126.com