孔晓东，夏中元，周斌，孟庆涛

(武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060)

参附注射液对糖尿病大鼠缺血再灌注损伤心肌DJ-1表达的影响

孔晓东，夏中元，周斌，孟庆涛

(武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060)

目的 观察参附注射液(SFI)对糖尿病大鼠缺血再灌注损伤(IR)心肌DJ-1表达的影响，并探究其对糖尿病IR心肌保护作用的分子机制。方法健康雄性SD大鼠腹腔注射60 mg/kg链尿佐菌素制备糖尿病模型。取糖尿病造模成功大鼠30只，随机数字表法分为三组(n=10)：假手术组(S组)、IR组、IR+SIF组。心肌IR模型采用结扎冠脉左前降支(LAD)30 min后松开120 min制备，S组只穿线包绕LDA而不结扎。IR+SFI组开胸前SFI以10 mL·kg-1·h-1持续泵注，开胸后以3 mL·kg-1·h-1持续输注至手术结束，其余两组泵注等量晶体液。检测SD大鼠心梗面积、血清肌酸激酶-MB(CK-MB)含量、心肌DJ-1表达，超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果与S组比较，IR组大鼠的心梗面积[(49.0±5.3)%vs(0.0±0.0)%]，CK-MB[(1 982±275)U/L vs(1 076±262)U/L]、MDA[(13.1±1.9)nmol/mg vs(7.6±1.1)nmol/mg]含量显著增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而DJ-1表达[(0.65±0.14)vs(1.0±0.0)]和SOD活性[(79.0±19.3)U/mg vs(143±15.4)U/mg]显著降低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；与IR组相比，IR+SFI组大鼠的心梗面积[(35.7±5.3)%vs(49.0±5.3)%]，CK-MB[(1 364±228)U/L vs (1 982±275)U/L]和MDA[(7.3±1.25)nmol/mg vs(13.1±1.9)nmol/mg]含量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而DJ-1表达[(0.9±0.14)vs(0.65±0.14)]和SOD活性[(119.4±14.6)U/mg vs(79.0±19.3)U/mg]显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论SFI能显著降低糖尿病心肌IR损伤的易损性，其机制可能与其上调心肌DJ-1表达、增强内源性抗氧化应激有关。

参附注射液；心肌缺血再灌注损伤；糖尿病；DJ-1；氧化应激

缺血性心脏病是糖尿病患者主要的心血管并发症及首要的致死原因。循证医学资料表明，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者一旦出现心肌缺血，其发生缺血再灌注(IR)损伤程度更重，预后更差，死亡率可达到非糖尿病患者的2～4倍[1]。DJ-1是近年发现的一种新型癌基因，研究显示它在对抗机体氧化应激方面扮演了十分重要的角色[2]，新近有证据表明，糖尿病心肌中DJ-1表达明显下调，这可能是糖尿病IR心肌易损性增加的重要原因[3]。参附注射液(SFI)是根据我国古典配方提取的中医急救药物，研究发现SFI对损伤脏器具有保护作用，亦有学者表明，SFI在糖尿病IR心肌的保护方面发挥了重要作用[4]，但具体机制尚未完全阐述明确。本文拟观察SFI对糖尿病IR心肌中DJ-1蛋白表达及氧化应激水平的影响，探讨SFI减轻糖尿病IR心肌易损性的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料 SPF级健康雄性SD大鼠，8周龄(体质量200～220 g)，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。链脲佐菌素(STZ)、戊巴比妥钠、TTC、伊文思蓝(美国，Sigma公司)，参附注射液(SFI，三九药业)，肌酸激酶-MB(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)ELISA检测试剂盒(武汉，Elabscience公司)，兔抗鼠DJ-1一抗(美国，CST公司)。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立 大鼠适应性喂养3 d，禁食12 h，采用腹腔单次注射STZ 60 mg/kg制备1型糖尿病大鼠模型，72 h检测尾静脉采血空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，之后每周检测血糖一次。所有动物均饲养于武汉大学人民医院动物房，采用普食喂养，自由饮水。

1.3 大鼠分组及给药 糖尿病模型诱导成功8周后，取30只大鼠按随机数表法分为3组(n=10)：假手术组(S组)、IR组和IR+SFI组。IR+SFI组于开胸前经股静脉持续泵注SFI 10 mL·kg-1·h-1，开胸后改为3 mL·kg-1·h-1，其余两组开胸前后持续泵注等量晶体液[4]。

1.4 心肌IR损伤模型的制备 腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉后固定，行气管切开插管术，接DW-2000型动物呼吸机机械通气。皮下心电监测Ⅱ导联心电图。开胸后暴露心脏，采用6-0结扎线包绕冠状动脉左前降支(LAD)根部。稳定15 min后采用结扎LAD 30 min后松开结扎线再灌注120 min的方式制备心肌IR模型。LAD结扎成功标准为：心电图ST段进行性抬高，心尖变白，左室壁运动受限。再灌注成功标准为：ST段回落，心尖复红。S组只穿线不结扎LAD。

1.5 心梗面积测定 再灌注结束后原位重新结扎LAD，股静脉注入3%伊文思蓝1 mL，待心脏充分染成蓝色后迅速摘取心脏，立即置于-20℃下冷冻30 min，于特制凹槽内沿心脏长轴方向将其切成2 mm薄片，置于1%TTC中37℃恒温中染色15 min。正常心肌染成蓝色，危险区心肌砖红色，梗死区心肌为白色。扫描，用Image-ProPlus6.0软件计算缺血区和梗死区面积。

1.6 血清CK-MB检测 再灌注结束时取右颈动脉血2 mL，4℃离心取上清液，采用ELISA法检测血清CK-MB水平。

1.7 心肌DJ-1表达测定 取左室组织，RIPA裂解液裂解，充分匀浆，于4℃离心15 min，取上清，用BCA法测蛋白浓度。免疫印迹时加上样缓冲液，煮沸5 min，行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，于兔抗鼠DJ-1抗体，GAPDH抗体4℃孵育过夜；于羊抗兔荧光二抗室温孵育1 h；使用Odyssey红外扫描显影仪扫描并分析测定灰度值。

1.8 心肌SOD活性、MDA含量检测 再灌注结束后，取左室组织，采用ELISA法检测心肌SOD活性，MDA水平。

1.9 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SFI对心梗面积和血清CK-MB的影响 与IR组比较，IR+SFI组心肌梗死面积显著减小(P＜0.05)；IR组血清CK-MB含量显著高于S组，但SFI能显著降低IR组CK-MB含量(P＜0.05)，见表1。

2.2 SFI对心肌DJ-1蛋白表达的影响 与S组比较，IR组心肌DJ-1蛋白表达明显降低(P＜0.05)。与IR组比较，IR+SFI组心肌DJ-1蛋白含量显著增加(P＜0.05)，见表1和图1。

图1 SFI对糖尿病IR心肌DJ-1蛋白表达的影响

2.3 SFI对心肌SOD活性和MDA含量的影响 与S组比较，IR组心肌SOD活性显著下降，MDA含量显著增加；而SFI能显著增加IR心肌SOD活性，降低MDA含量(均P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠心梗面积、血清CK-MB、心肌DJ-1蛋白、SOD和MDA含量比较(n=6，±s)

表1 各组大鼠心梗面积、血清CK-MB、心肌DJ-1蛋白、SOD和MDA含量比较(n=6，±s)

注：IR组心梗面积与IR+SIF组比较，t=3.99。与S组比较，aP＜0.05；与IR组比较，bP＜0.05。

组别DJ-1蛋白S组IR组IR+SFI组F值P值心梗面积(%) 0.0±0.0 49.0±5.3 35.7±5.3b173.6＜0.000 1 CK-MB (U/L) 1076±261.7 1982±275.1a1364±228.0b16.39 0.000 4 1.0±0.0 0.65±0.14a0.90±0.14b13.04 0.001 SOD (U/mg) 143.1±15.4 79.0±19.3a119.4±14.6b19.17 0.000 2 MDA (nmol/mg) 7.6±1.1 13.1±1.9a7.3±1.2b24.43＜0.000 1

3 讨 论

由于高血糖、高血脂以及活性氧自由基积聚，早期的糖尿病患者即可出现典型心肌病变，表现为心肌肥大、心脏舒张和收缩功能障碍等。此类患者一旦发生缺血性心脏病，其危害性和致死率远高于非糖尿病患者。本研究参照Xue等[5]的方法，采用腹腔注射STZ诱导1型糖尿病大鼠模型，通过结扎LAD 30 min开放120 min的方法建立心肌IR模型，以完成后续研究。

SFI是红参和附子的提取物，其主要有效成分包含人参皂甙和乌头碱类。研究表明人参皂甙有较强的抗心肌IR损伤作用，且在动物试验和临床研究中得到了广泛的证实，其机制可能涉及减轻细胞内Ca2+超载、清除氧自由基、抗脂质氧化反应、抑制炎症介质产生、改善缺血心肌组织微循环等。此外，SFI还具有降血糖等抗糖尿病的作用[6-7]。在本研究中，我们发现SFI能显著减少糖尿病IR心肌的梗死面积，降低血清CK-MB水平，提示SFI具备抗糖尿病心肌IR损伤的作用，这与我们及他人的前期研究相一致。

DJ-1(PARK7)是近年来细胞生物学和病理生理学等相关学科的重要发现，作为一种新型癌基因，它广泛存在于人体的大脑、心脏、肾脏等脏器中。研究发现它编码的DJ-1蛋白是一种多功能蛋白，在维持人体正常生理活动及介导疾病的发生发展中发挥了十分重要的作用[8]，近年来其抗氧化应激的功能特性成为探讨热点。研究显示，DJ-1可通过自身结构和生化特异性、分子伴侣特性、胞核和线粒体稳定性等对抗机体的氧化应激水平[8]。Taira等[9]研究发现，DJ-1基因敲除后，细胞中与氧化应激、凋亡、细胞毒性等有关的基因表达增高，细胞对氧化应激的易损性增强。Liu等[3]在糖尿病大鼠中的研究发现，糖尿病心肌DJ-1的表达较正常心肌明显降低，这可能是糖尿病心肌氧化应激水平增高的重要原因之一。进一步的研究发现，糖尿病IR心肌中DJ-1的表达更加减少，这与本研究的结果相一致。此外，我们研究显示，SFI在增加糖尿病心肌对IR耐受性的同时，伴随着心肌组织DJ-1的显著上调，经过对氧化应激指标的检测，我们发现，SFI能显著增加心肌SOD活性，并降低心肌MDA含量。

综上所述，SFI可有效地减轻糖尿病IR心肌的易损性，其机制可能与其上调心肌DJ-1蛋白表达，从而减轻心肌细胞氧化应激水平有关。

[1]Beckman JA,Paneni F,Cosentino F,et al.Diabetes and vascular disease:pathophysiology,clinical consequences,and medical therapy: partⅡ[J].Eur Heart J,2013,34(31):2444-2452.

[2]Mccoy MK,Cookson MR.DJ-1 regulation of mitochondrial function and autophagy through oxidative stress[J].Autophagy,2011,7(5): 531-532.

[3]Liu M,Zhou B,Xia Z Y,et al.Hyperglycemia-induced inhibition of DJ-1 expression compromised the effectiveness of ischemic postconditioning cardioprotection in rats[J].Oxid Med Cell Longev,2013, 2013:564902.

[4]夏中元,江梦,肖业达,等.参附注射液对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时PTEN和P13 K表达的影响[J].中华麻醉学杂志,2009,29(6): 490-493.

[5]Xue R,Lei S,Xia ZY,et al.Selective inhibition of PTEN preserves ischaemic post-conditioning cardioprotection in STZ-induced type 1 diabetic rats:role of the PI3K/Akt and JAK2/STAT3 pathways[J]. Clin Sci(Lond),2016,130(5):377-392.

[6]Yang LJ,Wang J,Tian ZF,et al.Shenfu injection attenuates neonatal hypoxic-ischemic brain damage in rat[J].Neurol Sci,2013,34(9): 1571-1574.

[7]Guo ZJ,Li CS.Therapeutic effects of Shenfu Injection on post-cardiac arrest syndrome[J].Chin J Integr Med,2013,19(9):716-720.

[8]Dongworth RK,Mukherjee UA,Hall AR,et al.DJ-1 protects against cell death following acute cardiac ischemia-reperfusion injury[J]. Cell Death Dis,2014,5:e1082.

[9]Taira T,Takahashi K,Kitagawa R,et al.Molecular cloning of human and mouse DJ-1 genes and identification of Sp1-dependent activation of the human DJ-1 promoter[J].Gene,2001,263(1-2):285-292.

Effect of Shenfu injection on expression of DJ-1 in ischemia reperfusion myocardium of diabetic rats.

KONG Xiao-dong,XIA Zhong-yuan,ZHOU Bin,MENG Qing-tao.Department of Anesthesiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Shenfu injection(SFI)on expression of DJ-1 in diabetic ischemia reperfusion(IR)myocardium,and explore the mechanisms of its cardioprotection.MethodsType 1 diabetes models were induced by a single intraperitoneal of 60 mg/kg streptozotocin in healthy male SD rats(weighing 200-220 g),and confirmed by fasting blood glucose≥16.7 mmol/L.Thirty diabetic rats were randomly assigned into 3 groups(n=10 each):sham group(S group),IR group and IR+SFI group.Myocardium IR model was established by occlusion of the anterior descending branch of left coronary artery(LAD)for 30 min followed by 120 min reperfusion. LAD was exposed but not occluded in S group.In IR+SFI group,SFI was continuously pumped into femoral vein with 10 mL·kg-1·h-1before opening chest,and after that,it was continuously pumped with 3 mL·kg-1·h-1.Crystal injection was pumped in parallel in the other two groups.After 120 min reperfusion,hearts were removed for determination of infarct size,DJ-1 expression,superoxide dismutase(SOD)activity and malonaldehyde(MDA)release.Blood was collected for creatine kinase-MB(CK-MB)assay.ResultsCompared with S group,larger myocardium infarct size,higher CK-MB and MDA release,lower DJ-1 expression and SOD activity were detected in IR group,(49.0± 5.3)%vs(0.0±0.0)%,(1 982±275)U/L vs(1 076±262)U/L,(13.1±1.9)nmol/mg vs(7.6±1.1)nmol/mg,(0.65±0.14)vs (1.0±0.0),(79.0±19.3)U/mg vs(143±15.4)U/mg,P＜0.05.Compared with IR group,SFI significantly reduced myocardium infarct size,CK-MB and MDA release,and increased DJ-1 expression and SOD activity in IR+SFI group, (35.7±5.3)%vs(49.0±5.3)%,(1 364±228)U/L vs(1 982±275)U/L,(7.3±1.25)nmol/mg vs(13.1±1.9)nmol/mg,(0.9± 0.14)vs(0.65±0.14),(119.4±14.6)U/mg vs(79.0±19.3)U/mg,P＜0.05.ConclusionSFI can decrease the vulnerability of diabetic myocardium to IR injury.The mechanism is probably involving in DJ-1 activation,and then enhancing the ability of endogenous antioxidation.

Shenfu injection;Myocardianl ischemia reperfusion injury;Diabetes;DJ-1;Oxidative stress

R-332

A

1003—6350（2016）20—3273—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.002

2016-05-14)

国家自然科学基金(编号：81471844)

夏中元。E-mail：xiazhongyuanmz@aliyun.com