张风林，崔勇，鲍晶，丁学华，应奇

(1.中国人民解放军第411医院神经外科，上海 200081；2.上海长征医院神经外科，上海 200003)

DLC-1启动子甲基化与垂体腺瘤侵袭性的关系

张风林1，崔勇1，鲍晶1，丁学华2，应奇1

(1.中国人民解放军第411医院神经外科，上海 200081；2.上海长征医院神经外科，上海 200003)

目的 研究肝癌缺失基因1(DLC-1)启动子区CpG甲基化与人垂体腺瘤侵袭性的关系，探讨垂体腺瘤发生发展的分子机制。方法收集84例垂体腺瘤标本和6例尸检时获得的正常人垂体组织标本，利用实时荧光定量PCR的方法检测标本中DLC-1的表达水平，利用特异性聚合酶链反应(MSP)检测DLC-1基因启动子区CpG甲基化状态。结果DLC-1在垂体腺瘤标本中表达下降。6例正常人垂体组织标本中DLC-1基因启动子区无甲基化，49例侵袭性垂体腺瘤标本中有19例发生甲基化(38.78%)，35例非侵袭性垂体腺瘤标本中有3例发生甲基化(8.57%)，52例功能性垂体腺瘤标本中有15例发生甲基化（28.84%），32例无功能性垂体腺瘤标本中有7例发生甲基化(21.88%)。DLC-1在侵袭性垂体腺瘤组与非侵袭性垂体腺瘤组之间发生甲基化率比较差异有统计学意义（P＜0.05)，而在功能性垂体腺瘤组与无功能性垂体腺瘤组之间发生甲基化率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。DLC-1启动子甲基化与垂体腺瘤DLC-1表达量呈负相关(r=-0.67，P=0.01)。结论DLC-1基因启动子甲基化跟垂体腺瘤的发生发展有关，可作为垂体腺瘤侵袭性发生的重要标志。

垂体腺瘤；肝癌缺失基因1；侵袭性；甲基化；相关性

垂体腺瘤起源于颅内腺垂体细胞，占颅内肿瘤的10%～25%，属于良性肿瘤，但是仍然有近35%的垂体腺瘤生物学特征表现为侵袭性。侵袭性垂体腺瘤易于侵犯海绵窦、蝶窦、邻近硬脑膜以及颅骨。由于其特殊的病理特征，侵袭性垂体腺瘤全切率低且易于复发，治疗困难。垂体腺瘤的发病机制尚不完全清楚，近年来的研究表明侵袭性垂体腺瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的过程，DNA甲基化与垂体腺瘤的发生发展有密切关系[1]。前期研究中我们发现抑癌基因肝癌缺失基因1(DLC-1)在垂体腺瘤中表达下调[2]。本研究中我们分析了84例垂体腺瘤标本和6例尸检时获得的正常人垂体组织标本中DLC-1基因表达及其启动子区CpG甲基化状态，研究其与人垂体腺瘤侵袭性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集上海长征医院神经外科垂体腺瘤标本84例。其中功能性腺瘤52例(泌乳素腺瘤22例，生长激素腺瘤17例，促肾上腺素腺瘤8例，促甲状腺素腺瘤5例)，无功能腺瘤32例。肿瘤的侵袭性分组依据术前影像学检查以及术中所见，按照改良Hardy's分级，将84例垂体腺瘤分为侵袭性垂体腺瘤组49例和非侵袭性垂体腺瘤组35例，见表1。6例正常人垂体组织由尸检获得。

表1 垂体腺瘤病理学分类(例)

1.2 主要试剂 RNA抽提试剂(Trizol Reagent，Invitrogen)，DNA纯化试剂盒(Promega Wizard，A1120)，DNA纯化回收系统(Promega Wizard Cleanup，A7280)，热启动Taq酶(Takara Taq HS)。

1.3 实时荧光定量PCR检测DLC-1 mRNA的表达 内参照采用GAPDH。引物设计：DLC-1的上游引物5'-AGAAAGAAGCCGGACACCATGATCC-3'，下游引物3'-CCTTTGGAAAGTCCATTTGCCACTG-5'。内参照基因GAPDH检测引物如下：上游引物5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下 游 引 物3'-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-5'。运用2-△△CT法统计基因的相对表达量。

1.4 特异性聚合酶链反应(MSP)检测DLC-1基因启动子区CpG甲基化 首先使用DNA纯化试剂盒(Promega，A1120)进行基因组提取。取20 mg组织，加600µL核裂解液，匀浆30 s，65℃孵育30 min，加3µL核酸酶溶液，37℃混匀30 min，室温冷却。加200µL蛋白沉淀液，混匀，冰上放置5 min。13 000 r/min离心4 min。干净离心管中加600µL室温异丙醇，将上步离心中得到上清转移进来。混匀，离心。弃上清，加500µL室温70%乙醇，混匀，离心。倒掉乙醇，空气干燥沉淀15 min。用DNA补液重溶，4℃过夜。UV检测溶液浓度及纯度。基因组样品经过UV测定后，取2µg使用亚硫酸氢钠进行处理，阳性标准品也同时处理。经过亚硫酸氢钠处理模板完毕，使用DNA纯化回收系统(Promega，A7280)进行纯化，作为PCR的模板使用。最后进行PCR反应。甲基化特异性PCR引物设计：MDLC-F：5'-TTTAAAGATCGAAACGAGGGACG-3'，MDLC-R：3'-CCCAACGACCAACG AAAAAACCCGACTAACG-5'；非甲基化特异性PCR引物设计：UDLC-F：5'-TTTTTTAAAGATTGAAATGAGGGAGTG-3'，UDLC-R：3'-AAACCCAACAAAAA AACCCAACTAACA-5'。反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Primer 0.5 μL，纯化好的模板2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2μL，dd H2O 17.2 μL，Takara HS TAQ 0.3 μL。循环条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃33 s，72℃40 s，72℃8 min，4℃1 h，扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳15 min，紫外光照显带。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计学软件包进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用四格表χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。Spearman相关系数法检验DLC-1启动子甲基化和垂体腺瘤标本DLC-1表达量的相关性。

2 结 果

2.1 不同组标本中DLC-1的表达量比较 与正常垂体组织相比，DLC-1表达水平在垂体腺瘤组织中明显下调(P＜0.01)；进一步比较发现，DLC-1在侵袭性垂体腺瘤组织中的表达水平明显低于非侵袭性垂体腺瘤，差异有统计学意义(P＜0.05)，而功能性垂体腺瘤与无功能性垂体腺瘤比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 DLC-1在不同性质标本中表达水平(±s)

表2 DLC-1在不同性质标本中表达水平(±s)

组别 例数正常垂体组垂体腺瘤组t值P值侵袭性组非侵袭性组6 84 49 35表达量t值P值功能性垂体腺瘤无功能性垂体腺瘤t值P值52 32 0.90±0.22 0.51±0.35 2.683 0.009 0.40±0.38 0.66±0.24 3.568 0.001 0.50±0.35 0.52±0.36 0.252 0.802

2.2 不同组标本中DLC-1启动子甲基化状态比较 正常垂体组织中DLC-1启动子无甲基化。49例侵袭性垂体腺瘤标本中有19例发生甲基化(38.78%)，35例非侵袭性垂体腺瘤标本中有3例发生甲基化(8.57%)，52例功能性垂体腺瘤标本中有15例发生甲基化(28.84%)，32例无功能性垂体腺瘤标本中有7例发生甲基化(21.88%)，见图1。DLC-1侵袭性垂体腺瘤组与非侵袭性垂体腺瘤组之间发生甲基化率比较差异有统计学意义(χ2=9.64，P=0.02)，侵袭组垂体腺瘤发生甲基化频率高。在功能性垂体腺瘤组与无功能性垂体腺瘤组之间发生甲基化率比较差异无统计学意义(χ2=0.50，P=0.48)，见表3。

图1 不同组标本中DLC-1启动子甲基化状态

表3 DLC-1启动子在不同组标本中的甲基化状态(例)

2.3 DLC-1启动子甲基化与垂体腺瘤DLC-1表达量的相关性 DLC-1启动子甲基化与垂体腺瘤DLC-1表达量呈负相关，相关系数r=-0.67，P=0.01。

3 讨 论

垂体腺瘤属良性单克隆肿瘤，人群中患病率较高，约16.7%，只有少部分人会产生症状[3]。然而仍然有近1/3的垂体腺瘤具有侵袭性，这部分患者症状重，治疗效果差。目前判断垂体腺瘤侵袭性的发生尚无统一标准，主要依赖于影像学检查及手术所见，具有一定的局限性。如果能找到侵袭性发生的若干分子标志，将有助于早期判断垂体腺瘤侵袭性的发生，从而可以给予患者恰当的个体化治疗，提高治愈率，减少复发率。

DLC-1是1998年由Yuan等从人原发性肝癌细胞中克隆出来的一个候选抑癌基因。DLC-1蛋白是一种GAPs蛋白，参与调节细胞的多种生命活动，包括细胞骨架重组、细胞粘附、细胞周期、细胞分裂以及基因转录等。DLC-1在很多常见的人类肿瘤中表达下调或缺失，包括肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、肾癌和鼻咽肿瘤等，而DLC-1启动子甲基化正是DLC-1表达下调的重要原因[4-5]。在某些非恶性肿瘤中也发现了其表达水平降低，如子宫肌瘤和良胜增生的前列腺。已有的研究结果表明DLC-1作为一种人类肿瘤抑制基因广泛存在[6]，但其在人类垂体腺瘤中的表现尚未有研究。

本研究中笔者发现DLC-1在垂体腺瘤中表达明显降低，而DLC-1在侵袭性垂体腺瘤中的表达比非侵袭性垂体腺瘤表达水平更低。进一步研究发现侵袭组垂体腺瘤中DLC-1启动子发生甲基化频率高。DLC-1表达减少跟启动子甲基化率明显相关，提示DLC-1启动子甲基化正是DLC-1表达减少的重要原因。垂体腺瘤中DLC-1的这一分子特征与其在某些恶性肿瘤中的表现一致，启动子甲基化导致DLC-1表达减少可能是垂体腺瘤侵袭性发生发展的重要机制。功能性垂体腺瘤中DLC-1的表达水平与无功能垂体腺瘤差异无统计学意义，在功能性垂体腺瘤组与无功能性垂体腺瘤组之间DLC-1发生甲基化率差异亦无统计学意义，说明DLC-1在不同病理类型的垂体腺瘤中可能发挥同样的作用。

遗传学及表观遗传学的改变在垂体腺瘤的发生发展过程中发挥了巨大作用[7]，我们也在组织学上明确了DLC-1在垂体腺瘤与正常组织中的表达差异及其启动子甲基化状态，确认其与肿瘤的侵袭性密切相关，检测垂体腺瘤DLC-1启动子甲基化状态，有助于判断肿瘤的风险和预后。下一步我们将在细胞层面利用质粒转导技术导入DLC-1，以期研究DLC-1对垂体腺瘤细胞性状、活动的影响。

[1]Sapochnik M,Nieto LE,Fuertes M,et al.Molecular mechanisms underlying pituitary pathogenesis[J].Biochem Genet，2016,54(2): 107-119.

[2]张风林,丁学华,应奇,等.肝癌缺失基因-1在垂体腺瘤中的表达与腺瘤临床病理特征的关系[J].中华神经医学杂志,2012,11(1): 16-19.

[3]Theodros D,Patel M,Ruzevick J,et al.Pituitary adenomas:historical perspective,surgical management and future directions[J].CNS Oncol,2015,4(6):411-429.

[4]Kim TY,Vigil D,Der CJ,et al.Role of DLC-1,a tumor suppressor protein with RhoGAP activity,in regulation of the cytoskeleton and cell motility[J].Cancer Metastasis Rev,2009,28(1-2):77-83.

[5]Durkin ME,Yuan BZ,Zhou X,et al.DLC-1:a Rho GTPase-activating protein and tumour suppressor[J].J Cell Mol Med,2007,11(5): 1185-1207.

[6]Jiang Y,Li JM,Luo HQ.Clinicopathological significance of DLC-1 expression in cancer:a meta-analysis[J].Asian Pac J Cancer Prev, 2015,16(16):7255-7260.

[7]Melmed S.Pituitary tumors[J].Endocrinol Metab Clin North Am, 2015,44(1):1-9.

Relationship between DLC-1 promoter methylation and invasion of pituitary adenomas.

ZHANG Feng-lin1,CUI Yong1,BAO Jing1,DING Xue-hua2,YING Qi1.1.Department of Neurosurgery,the 411thHospital of Chinese PLA, Shanghai 200081,CHINA;2.Department of Neurosurgery,Changzheng Hospital,Shanghai 200003,CHINA

Objective To study the relationship between CpG methylation in promoter region of deleted in liver cancer-1(DLC-1)and invasion of human pituitary adenomas,and to explore the molecular mechanisms of the occurrence and development of the pituitary adenoma.MethodsPituitary tissue samples were collected from patients with pituitary adenomas(n=84)and normal people(n=6,by autopsy).Real-time quantitative PCR was used to detect DLC-1 expression levels,and methylation-specific polymerase chain reaction(MSP)was used to detect the CpG methylation status in promoter region of DLC-1 gene.ResultsDLC-1 expression decreased in samples of pituitary adenomas.The 6 cases of normal human pituitary tissue samples showed no methylation in DLC-1 gene promoter region.Methylation was found in 19 cases(38.78%)among the 49 cases of invasive pituitary adenoma specimens,3 cases(8.57%)among 35 cases of noninvasive pituitary adenomas,15 cases(28.84%)among the 52 cases of functional pituitary adenomas,and 7 cases(21.88%)among 32 cases of non-functional pituitary adenomas.There was a significant difference in the incidence of methylation between the invasive pituitary adenomas group and noninvasive pituitary adenomas group(P＜0.05). There was no significant difference in the incidence of methylation between the functional pituitary adenoma group and the non-functional pituitary adenoma group(P＞0.05).DLC-1 gene promoter methylation was negatively correlated with DLC-1 expression in pituitary adenoma(R=-0.67,P=0.01).ConclusionDLC-1 gene promoter methylation is related to the occurrence and development of pituitary adenomas,which can be used as an important indicator for the occurrence of invasive pituitary adenomas.

Pituitary adenoma;Deleted in liver cancer-1(DLC-1);Invasion;Methylation;Correlation

R736.4

A

1003—6350（2016）20—3283—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.005

2016-04-08)

上海市虹口区卫生和计划生育委员会科研资助课题(编号：虹卫1403-21)

应奇。E-mail：yingqi411@sina.com