赵珮伶，任婷婷，祝娟娟，程明亮，王珺

(1贵州医科大学,贵阳 550004；2贵州医科大学附属医院)

蓝莓原浆联合益生菌灌胃治疗大鼠非酒精性脂肪肝的效果及其机制

赵珮伶1，任婷婷1，祝娟娟1，程明亮1，王珺2

(1贵州医科大学,贵阳 550004；2贵州医科大学附属医院)

目的 观察蓝莓原浆联合益生菌灌胃治疗大鼠非酒精性脂肪肝的效果，并探讨其机制。 方法 选取50只雄性SD大鼠，随机分为正常组(NC组)、模型组(MC组)、蓝莓原浆益生菌低剂量组(BPL组)、蓝莓原浆益生菌中剂量组(BPM组)、蓝莓原浆益生菌高剂量组(BPH组)。除NC组外其余4组均喂养高脂饲料制备非酒精性脂肪肝模型。BPL、BPM、BPH组造模后给予蓝莓原浆原浆0.25、0.5、1.0 mL/100g和益生菌0.53×107、1.05×107、2.10×107CFU灌胃，1次/d。共12 周。第12周末观察各组大鼠一般情况，然后处死大鼠，取血分离血清，检测血清ALT、AST、TG、TC、LDL、HDL；取肝组织行HE及油红O染色，光镜下观察肝组织病理变化；用TUNEL法检测肝组织肝细胞凋亡指数(AI)；用免疫组化法和Western blotting法检测肝组织Fas、FasL蛋白；用实时荧光定量PCR法检测肝组织Fas、FasL mRNA 。 结果 与MC组相比，BPL、BPM、BPH组大鼠血清中HDL、TG、TC、ALT、AST降低(P均<0.05)、LDL升高(P均<均0.05), 肝组织脂肪沉积减少, 肝细胞AI降低(P均<0.05), Fas、FasL蛋白和mRNA表达均降低(P均<0.05)。与BPL、BPM组相比，BPH组上述变化下降较为显著。结论 蓝莓原浆联合益生菌治疗高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪肝，能改善肝功能，减轻肝组织病理损伤，其机制可能与蓝莓原浆联合益生菌抑制肝细胞Fas、FasL表达继而抑制肝细胞凋亡有关。

蓝莓原浆；益生菌；非酒精性脂肪性肝病；脂肪酸合成酶；脂肪酸合成酶配体；细胞凋亡

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包括非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。病理性氧化应激致使肝细胞受损，进一步诱发肝细胞过度凋亡是NAFLD发生发展的关键[1，2]。NAFLD发生过程中，细胞凋亡是肝细胞损伤和炎症与脂肪化的枢纽，持续氧化应激加剧炎症反应及肝细胞变性，进一步损伤肝细胞并诱发凋亡，加快NAFLD发展[3]。脂肪酸合成酶(Fas)及其配体FasL参与细胞凋亡相关受体信号转导过程[4]。益生菌可改善肠道内菌群失调，减轻肠道内毒素水平及肝细胞凋亡。本课题组前期研究表明, 蓝莓原浆有显著的抗氧化效能且可预防大鼠的NAFLD。但未见将蓝莓原浆和益生菌联合治疗大鼠NAFL的报道。本研究观察了蓝莓原浆联合益生菌灌胃对NAFL大鼠肝功能、肝脏病理损伤程度、肝细胞凋亡程度和肝组织Fas、FasL表达的影响，评价蓝莓原浆联合益生菌治疗大鼠NAFL的效果并探讨其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠50只, 清洁级, 体质量(155±20)g，购自贵州医科大学动物实验中心(批号SYXK黔2012-0001)。蓝莓原浆购自贵州省麻江县蓝莓原浆基地。益生菌(含嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌活菌)购自上海信谊药业有限公司，规格: 210 mg /胶囊，含活菌5×107CFU/g。高脂饲料成分为88.2%普通饲料+10%猪油+1.5%胆固醇+0.2%胆酸钠，购自江苏美迪森生物有限公司，批号MD1205。Tunnel试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，兔抗鼠Fas、FasL多克隆抗体购自Abcam公司，兔抗鼠Fas、FasL多克隆抗体(Abcam公司)，兔抗鼠一抗和β-actin购自博士德生物技术有限公司，羊抗兔二抗标记物辣根过氧化物酶购自上海基因工程部，BCA定量蛋白试剂盒购自Biomiga公司，ECL化学发光试剂购自百乐公司，总RNA提取纯化试剂盒购自Biomiga公司，SYBR PremixEx Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)、RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自宝生物工程有限公司(批号RR047A)，Fas、FasL、β-actin引物购自宝生物工程有限公司,ViiA7 Real-time PCR System购自美国Applied 公司，NANO-drop 2000超微量分光光度计购自美国Thermal scientific公司，EPS-601电泳仪购自美国Amersham公司，SynergyH4多功能酶标仪购自美国Biotek公司，Olympus BX41显微镜图像采集系统购自日本Olympus公司。

1.2 大鼠分组及蓝莓原浆、益生菌应用 将50只大鼠随机分为正常组(NC组)、模型组(MC组)、蓝莓原浆益生菌低剂量组(BPL组)、蓝莓原浆益生菌中剂量组(BPM组)、蓝莓原浆益生菌高剂量组(BPH组)，每组10只。除NC组外其余4组均喂养高脂饲料制备NAFL模型。BPL、BPM、BPH组造模后给予蓝莓原浆原浆0.25、0.5、1.0 mL/100 g[5]和益生菌0.53×107、1.05×107、2.10×107CFU灌胃，1次/d。共12 周。NC和MC组每天给予等量生理盐水灌胃,共12 周。

1.3 各组大鼠一般情况观察 观察记录第12周各组大鼠一般情况，包括精神、反应、活动。

1.4 各组大鼠血清肝功能、血脂指标检测 第12周末处死各组大鼠，眼动脉放血取血，分离血清，用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、TG、TC、LDL、HDL。

1.5 各组大鼠肝组织脂肪变性情况及肝细胞内脂滴观察 第12周末处死各组大鼠,提取肝上叶组织用4%甲醛固定，常规制作切片，行HE染色，光镜下观察肝组织损伤情况；行油红O染色观察肝细胞内脂滴。

1.6 各组大鼠肝组织肝细胞凋亡指数(AI)测算 取上述切片，常规脱蜡，蛋白酶K 修复，滴加TUNEL 混合液标记DNA片段，行DAB 显色、复染，常规脱水透明，中性树胶封片，普通显微镜下观察。细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。每张盖玻片随机选取5 个400 倍不连续视野，每个视野计数100个细胞，计算各视野凋亡细胞占计数细胞总数的百分比，取其平均数为AI。

1.7 各组大鼠肝组织Fas、FasL蛋白检测 ①免疫组化法:取上述肝组织切片行修复抗原、灭活内源性酶，滴加一抗1∶1 000(山羊抗鼠Fas、FasL多克隆抗体)，滴加通用型二抗1∶2 500，行DAB 显色和复染，常规封片。在每张盖玻片随机选取5 个400 倍不连续视野，观察 Fas、FasL蛋白表达。Fas、FasL蛋白表达于肝细胞胞质中会呈现棕褐色颗粒。肝细胞胞质呈棕褐色为阳性染色。用Image-Pro Plus6.0系统分析图像，Fas、FasL蛋白表达量用平均积分光密度值(AIOD)表示。②Western blotting法: 取各组大鼠肝组织，参照TRIzol试剂盒说明提取胞质蛋白, 加热变性后行SDS-PAGE电泳，印记至PVDF 膜，一抗1∶2 000杂交4 ℃过夜, 二抗1∶10 000避光室温杂交1 h, 化学发光剂曝光显影, Gel DocEQ仪器扫描, Quantity One软件分析结果。以β-actin为内参照，结果用目标蛋白表达量用其蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示。

1.8 各组大鼠肝组织Fas、FasL mRNA检测 采用逆转录实时定量PCR法。取各组大鼠肝组织，采用一步法提取100 g肝组织中的总RNA并纯化，分析其完整性，测定RNA的浓度及纯度，按First Stmnd cDNA synthesis Kit说明书进行逆转录合成cDNA后行qRT-PCR。以β-actin为内参照。Fas上游引物为5′- CTGGAATCCCAAGTCCTGAA-3′, 下游引物为5′- TAAAGCTTGACACGCACCAG-3′;FasL上游引物为5′- TAAAGCTTGACACGCACCAG-3′, 下游引物为5′- CAATGGGACACTGGCTTTTT-3′;β-actin上游引物为5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′，下游引物为5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3′。用2-ΔΔCt表示各组大鼠肝组织Fas、FasL mRNA相对表达量。

2 结果

NC组大鼠精神充沛、反应敏捷、活动正常，其余组大鼠精神萎靡、反应愚钝、活动减少。与MC组相比，BPL、BPM、BPH组大鼠精神可，反应稍好，活动稍多。

2.1 各组大鼠血清肝功能和血脂指标比较 各组大鼠血清肝功能和血脂见表1。由表1可见，与NC组相比，MC、BPL、BPM、BPH组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL高(P均<0.05)，HDL低(P均<0.05)。与MC组相比，BPL、BPM、BPH组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL低(P均<0.05)，HDL高(P均<0.05)。BPL组和BPM组上述指标相比，P均>0.05。与BPL组和BPM组相比，BPH组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL低(P均<0.05)，HDL高(P均<0.05)。

2.2 各组大鼠肝组织脂肪变性情况及肝细胞内脂滴比较 HE染色显示NC组大鼠肝小叶和细胞无异常。MC组大鼠肝实质脂肪广泛变性，其小叶结构紊乱，细胞弥漫性脂肪样变，胞质有不同形状的脂滴空泡，核变性或偏于一侧，门管区及腺泡内可见细胞碎屑样坏死和炎性浸润。BPL组和BPM组脂肪变性程度较MC组略有差异,BPH组肝组织脂肪变性较轻，小叶形态和肝索布局欠完整，肝细胞轻度脂肪变，细胞内的炎性浸润和坏死明显减少。油红O染色显示NC组肝细胞正常;MC组肝细胞边沿稍融合，核多呈印戒状损伤且形状不规则，胞质聚集橘红色脂滴。BPL、BPM、BPH组较MC组肝细胞形态有所改善，脂滴沉积相对减少，其中BPH组改善最为明显。

表1 各组大鼠肝功能指标和血脂水平比较±s)

注：与NC组相比，△P<0.05;与MC组相比，▲P<0.05；与BPL、BPM组相比，#P<0.05。

2.3 各组大鼠肝组织AI比较 NC、MC、BPL、BPM、BPH组肝组织AI分别为4.82%±1.13%、30.10%±2.67%、25.38%±1.79%、22.32%±3.14%、14.93%±2.45%。与NC组相比，MC、BPL、BPM、BPH组肝组织AI高(P均<0.05)；与MC组相比，BPL、BPM、BPH组肝组织AI低(P均<0.05)；与BPH组相比，BPM、BPL组肝组织AI低(P均<0.05)；BPM、BPL组肝组织AI相比,P>0.05。

2.4 各组大鼠肝组织Fas、FasL蛋白比较 各组大鼠肝组织Fas、FasL蛋白AIOD和相对表达量见表2。与NC组相比，MC、BPL、BPM、BPH组肝组织Fas、FasL蛋白AIOD和相对表达量高(P均<0.05)；与MC组相比，BPL、BPM、BPH组肝组织Fas、FasL蛋白AIOD和相对表达量低(P均<0.05)；与BPH组相比，BPM、BPL组肝组织Fas、FasL蛋白AIOD和相对表达量低(P均<0.05)；BPM、BPL组肝组织Fas、FasL蛋白AIOD和相对表达量相比,P均>0.05。

表2 各组大鼠肝组织Fas、FasL蛋白AIOD和相对表达量比较

注：与NC组相比，△P<0.05;与MC组相比，▲P<0.05；与BPL、BPM组相比，#P<0.05。

2.6 各组大鼠肝组织Fas、FasL mRNA比较 各组大鼠肝组织Fas、FasL mRNA见表3。与NC组相比，MC、BPL、BPM、BPH组肝组织Fas、FasL mRNA较高(P均<0.05)；与MC组相比，BPL、BPM、BPH组肝组织Fas、FasL mRNA较低(P均<0.05)；与BPH组相比，BPM、BPL组肝组织Fas、FasL mRNA较低(P均<0.05)；BPM、BPL组肝组织Fas、FasL mRNA相比，P均>0.05。

表3 各组大鼠肝组织Fas、FasL mRNA比较

注：与NC组相比，△P<0.05;与MC组相比，▲P<0.05；与BPL、BPM组相比，#P<0.05。

3 讨论

NAFLD与肥胖、糖尿病、脂肪代谢紊乱、内毒素显著相关，疾病发展由NAFL、NASH向其相关硬化和癌症演变[7，8]。凋亡在NAFLD中是触发NAFL向可能发展为肝纤维化和肝癌的 NASH进展的关键[9，10]。在NAFLD病程中，肝脏中大量的游离脂肪酸(FFAs)堆积将诱发肝细胞凋亡[11]。研究表明，其凋亡的历程能趋化中性粒细胞并释放TNF-α等炎症因子，通过NF-κB和JNK等信号通路触发炎症，加重炎症反应[12]。凋亡小体通过激活肝星状细胞HSC或者Kuffer细胞，促肝纤维化形成,导致NAFLD病程进展[12、13]。

在细胞凋亡中，Fas/ FasL 系统主导凋亡性死亡受体信号转导通路。FasL诱导Fas 结合后形成三聚体，使死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)在细胞内受体区域募集，形成死亡诱导信号复合体(DISC)，触发半胱天冬家族酶链反应，最终破坏细胞微结构，导致细胞凋亡[14]。

目前调整饮食和生活方式的是治疗NAFLD的主要手段[7]。蓝莓原浆具有强大的抗氧化效果，可清除生物体内的超氧阴离子自由基和减少炎症损伤。本课题组前期研究发现[15]，蓝莓原浆调控HO-1、Nrf2蛋白的表达可增强肝细胞的抗氧化性，抑制细胞脂质过氧化，治疗NAFLD。蓝莓原浆还可以上调Bcl-2/bax的表达，阻遏NAFLD启动程序性死亡[16]。益生菌具有修复肠道保护性屏障,降低肠源性内毒素水平和提升免疫系统活性等生理功能。NAFLD疾病严重程度同肠道菌群失调以及代谢变化密切相关[18]。Esposito等[18]研究表明益生菌通过减少高脂饮食诱导的小鼠肝脂质过氧化，降低TNF-α和NF-κB表达和的增强抗炎作用，缓解NAFLD小鼠的症状。

本研究结果显示，与NC组相比，MC组大鼠精神情况欠佳；血清LDL、ALT、AST、TG、TC高，HDL低；肝小叶结构紊乱，有炎性浸润、肝实质细胞脂肪变性及坏死；肝组织有红色脂滴聚集；肝组织AI高；肝组织Fas、FasL表达高。说明高脂饮食致使大鼠代谢紊乱，肝脏脂质堆积，肝细胞炎性聚集及坏死，上调Fas、FasL表达，进一步诱导大量细胞凋亡，可促发大鼠NAFLD病情进展。与MC组相比，BPL、BPM、BPH组大鼠血清LDL、ALT、AST、TG、TC低，HDL高，肝组织，小叶结构较完整，肝索清晰，肝组织中脂肪变性、坏死和炎性浸润减少。提示蓝莓原浆联合益生菌能纠正NAFLD大鼠体内糖脂代谢紊乱，减少肝脏脂肪沉淀，对抗氧化和炎症损伤,对肝有一定的保护作用。但BPL和BPM组大鼠血清学指标、肝组织病理学改变无明显差异性改变，表明蓝莓原浆联合益生菌对NAFL的治疗效果无明显量效关系。与BPL组和BPM组相比，BPH组大鼠肝组织AI及Fas、FasL表达下降最为明显，且有统计学意义，说明高剂量的蓝莓原浆联合益生菌的干预作用效果显著。与BPL组相比，BPM组大鼠肝组织AI及Fas、FasL表达差异无统计学意义,说明蓝莓原浆联合益生菌中低剂量干预效果相当。

综上所述，蓝莓原浆联合益生菌治疗高脂饮食诱导的大鼠NAFL，能改善肝功能，减轻肝组织病理损伤，其机制可能与蓝莓原浆联合益生菌抑制肝细胞Fas、FasL表达继而抑制凋亡有关。

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国家自然科学基金资助项目(81560100)；贵州省科技厅攻关项目(20103017)；黔东南苗族侗族自治州林业局科研基金资助项目(LYJZFCG-2012-7)。

程明亮(E-mail： chengml@21cn.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.009

R575.5

A

1002-266X(2016)47-0032-04

2016-07-24)