李建厂，孙维梅，贾秀红，唐慎华，李晓花

(滨州医学院附属医院，山东滨州256603)

转染CDX2-siRNA并加入人参皂苷Rh2培养的K562细胞增殖抑制率、凋亡率变化

李建厂，孙维梅，贾秀红，唐慎华，李晓花

(滨州医学院附属医院，山东滨州256603)

目的 观察转染尾型同源盒基因(CDX2)siRNA并加入人参皂苷Rh2培养的人慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞增殖抑制率、凋亡率变化。方法 将对数生长期的人慢性粒细胞白血病K562细胞，分为实验组和对照组，实验组包括A、B、C组,A组不转染，B、C组分别转染CDX2-siRNA和阴性对照序列(CDX2-siRNA-NC)，然后实验组均加入60 μmol/L的人参皂苷Rh2培养。对照组K562细胞常规培养。培养6、12、24、36、48 h采用MTT法测算各实验组细胞增殖抑制率；培养48 h采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法和流式细胞术测算各实验组细胞凋亡率。培养48 h时采用实时荧光定量PCR法检测各实验组细胞CDX2、Ph标记染色体或(和)BCR/ABL基因重排(BCR-ABL融合基因)mRNA，采用Western blotting法检测各组细胞CDX2、BCR-ABL融合蛋白。结果 培养6、12、24、36、48 h时B组细胞增殖抑制率均高于A、C组(P均<0.05)。培养48 h时A、B、C组的细胞凋亡率分别为26.50%±0.72%、73.20%±1.06%、32.00%±1.34%,B组细胞凋亡率均高于A、C组。培养48 h时，B组细胞CDX2、BCR-ABL融合基因mRNA及蛋白相对表达量均低于A、C组，P均<0.05。结论 转染CDX2-siRNA并加入人参皂苷Rh2培养的人慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞增殖抑制率、凋亡率升高，这可能是转染CDX2-siRNA降低K562细胞CDX2表达，然后降低BCR-ABL融合基因表达导致的。

基因系尾型同源盒基因白血病；人慢性粒细胞白血病；人参皂苷；细胞增殖；细胞凋亡；Ph标记染色体或(和)BCR/ABL基因

人参为五加科人参属植物[1]，是一种具有重要药用价值的中草药，人参皂苷Rh2是一种原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物，具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、逆转细胞多药耐药性等抗肿瘤生物活性[2]，可抑制胃癌[3]、胶质瘤[4]、白血病[5]等肿瘤细胞的增殖,但是效果不明显[6]。基因系尾型同源盒基因(CDX2)是是一种在早期胚胎发育过程中发挥重要作用的调节因子，与白血病的发生、发展及转归关系密切[7]。通过转染CDX2-siRNA沉默人慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞CDX2基因表达，然后再用人参皂苷Rh2培养是否会增加K562细胞增殖抑制率和凋亡率尚不明确。2014年10月～2015年5月，我们观察了转染CDX2-siRNA加入人参皂苷Rh2培养的K562细胞增殖抑制率和凋亡率变化，并探讨其可能机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、材料及试剂 人慢性粒细胞白血病细胞株K562由滨州医学院肿瘤与分子生物学重点实验室保存，接种于含10%胎牛血清、青链霉素浓度为1%的RPMI1640培养基中，置于37.0 ℃、5%CO2、饱和湿度的无菌培养箱中培养，1～2 d传代1次。RPMI1640、胎牛血清购自美国Hyclone公司；人参皂苷单体Rh2购自南京泽朗医药科技有限公司(纯度98%)；细胞总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；CDX2、Ph标记染色体或(和)BLL/ABL基因(BCR-ABL)、β-actin上下游引物交由上海生物工程公司设计合成；CDX2 一抗、GAPDH一抗购自武汉博奥森公司，BCR-ABL一抗购自Abcam 公司，二抗购自杭州贤至公司，SDS-PAGE凝胶配置试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；MTT购自美国Sigma公司；细胞凋亡试剂盒购自南京凯基公司。其他试剂均为国产分析纯。CDX2-siRNA及阴性对照序列(CDX2-siRNA-NC)均由上海吉玛制药有限技术公司合成。

1.2 K562细胞分组、转染及人参皂苷Rh2应用方法 取对数生长期K562细胞，0.8×106/孔接种于6孔板，分为A、B、C组3个实验组，每组6个复孔。A组不转染，B、C组分别转染CDX2-siRNA和阴性对照序列(CDX2-siRNA-NC)，然后三组均用60 μmol/L的人参皂苷Rh2培养。另设空白对照组，为常规培养的K562细胞。 继续培养。

1.3 各实验组细胞CDX2 mRNA及蛋白检测 ①采用RT-PCR法检测培养48 h时各组CDX2 mRNA。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行CDX2上游引物为5′-GAACCTGTGCGAGTGGATG-3′，下游引物为5′-GGATGGTGATGTAGCGACTG-3′，扩增片段长度150 bp；内参β-actin上游引物为5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物为5′- GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′，扩增片段长度150 bp。反应条件：95 ℃、30 s预变性，95 ℃、5 s，60 ℃、15 s，45个循环。采用2-ΔΔCT法计算各组CDX2 mRNA的相对表达量。②采用Western blotting法检测培养48 h时各组细胞CDX2 蛋白。裂解细胞， BCA法测定蛋白浓度， 8% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF膜，7%脱脂奶粉室温封闭2.5 h，TBST洗净，加入兔抗人CDX2单抗(1∶500)、兔抗人GAPDH单抗(1∶1 000)，4 ℃摇床封闭过夜；TBST清洗4次，每次15 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温摇床封闭2 h，TBST清洗4次，每次10 min，经ECL发光显色系统拍照显影；以GAPDH为内参，各实验组细胞CDX2的相对表达量以目的条带和GAPDH条带灰度值之比表示。实验重复3次，取平均值。

1.4 各实验组细胞增殖抑制率测算 采用MTT法。分别于培养6、12、24、36、48 h取各实验组和空白对照组细胞，0.8×104/孔接种于96孔板，每组6个复孔。PBS冲洗后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT,继续孵育4 h，4 ℃下1 000 r/min离心10 min，弃上清，每孔加入150 mL DMSO，室温避光震荡5 min，采用分光光度计测定各孔490 nm处光密度(OD)值。实验组细胞增殖抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值×100%。

1.5 各实验组凋亡细胞检测 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法和流式细胞术。取培养48 h时各组细胞，4×105/孔接种于6孔板，每组6个复孔。800 r/min离心5 min，收集各组细胞，PBS洗3遍，吸弃上清，加入500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 混匀，加入5 μL Propidium Iodide 混匀,室温避光反应15 min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.6 各实验组细胞BCR-ABL融合基因mRNA及蛋白检测 ①采用RT-PCR法检测培养48 h时各组BCR-ABL融合基因mRNA。BCR-ABL融合基因上游引物为：5′-CTTCTCCCTGGCATCCGTGGA-3′，下游引物为5′-TGCAACGAAAAGGTTGGGGT-3′，扩增片段长度155 bp。其余同“1.3”。②采用Western Blotting法检测培养48 h时各组细胞BCR-ABL融合蛋白。裂解细胞， BCA法测定蛋白浓度， 8% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF膜，7%脱脂奶粉室温封闭2.5 h，TBST洗净，加入兔抗人CDX2单抗(1∶500)、BCR-ABL单抗(1∶1 000)、兔抗人GAPDH单抗(1∶1 000)，4 ℃摇床封闭过夜；TBST清洗4次，每次15 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温摇床封闭2 h，TBST清洗4次，每次10 min，经ECL发光显色系统拍照显影；以GAPDH为内参，各实验组细胞CDX2、BCR-ABL蛋白的相对表达量以目的条带和GAPDH条带灰度值之比表示。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各实验组细胞CDX2表达比较 培养48 h各组细胞CDX2 mRNA及蛋白相对表达量见表1。B组细胞CDX2 mRNA及蛋白相对表达量均低于A、C组，P均<0.05；A、C组细胞CDX2 mRNA及蛋白相对表达量相比P均>0.05。

2.2 各实验组细胞增殖抑制率比较 培养6、12、24、36、48 h各组细胞增殖抑制率比较见表2。培养6、12、24、36、48 h时B组细胞增殖抑制率均高于A、C组，P均<0.05；A、C组细胞增殖抑制率相比P>0.05。

表1 不同时点各实验组细胞增殖抑制率比较±s)

注：与A、C组比较，＊P<0.05。

2.3 各实验组细胞凋亡率比较 培养48 h时A、B、C组的细胞凋亡率分别为26.50%±0.72%、73.20%±1.06%、32.00%±1.34%,B组细胞凋亡率均高于A、C组，P均<0.05;A、C组细胞凋亡率相比P>0.05。

2.4 各实验组细胞BCR-ABL mRNA及蛋白相对表达量比较 培养48 h各实验组细胞BCR-ABL mRNA及蛋白相对表达量见表2。B组细胞BCR-ABL mRNA及蛋白相对表达量均低于A、C组，P均<0.05；A、C组细胞BCR-ABL融合基因mRNA及蛋白相对表达量相比，P均>0.05。

表2 各实验组细胞CDX2、BCR-ABL mRNA及蛋白相对表达量比较±s)

注：与A、C组比较，＊P<0.05。

3 讨论

CDX2是一种在早期胚胎发育过程中发挥重要作用的调节因子，该基因与白血病的发生、发展及转归关系密切。Thoene 等[9]研究发现，CDX2异常表达于造血干细胞会成为作用强大的原癌基因，进一步导致细胞恶性增殖。Rawat等[10]通过对急性单核白血病发病机制的研究发现，CDX2在造血系统疾病中存在异常表达，可以促进髓母细胞自我更新和增殖，并且对下游HOX基因表达有一定的调节作用。此外，Saegusa 等[11]研究发现，CDX2能够通过与β-连环蛋白联合作用，共同参与诱导白血病的分化障碍。由此可知，CDX2能够通过影响白血病细胞内多种信号通路的表达，从而进一步影响肿瘤细胞的增殖、凋亡。

具有多向分化潜能的BCR-ABL融合基因是人慢性粒细胞白血病细胞K562细胞的分子遗传学特征之一[8]。BCR-ABL融合蛋白能够通过其过度活跃的酪氨酸激酶活性使多种目标蛋白磷酸化，进而激活多种信号通路，导致造血干祖细胞异常增殖，引起疾病发生[12，13]。已经有研究证实，通过RNA技术沉默BCR-ABL基因表达后，可能明显抑制白血病细胞增殖，并促进其凋亡[14]。

研究证实，Rh2对白血病细胞株KG1α具有明显的增殖抑制作用，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin/TCF4/CyclinD1 信号通路有关[15]。Choi等[16]则通过研究发现，Rh2能够通过影响细胞抗凋亡/促凋亡蛋白的活性而发挥其促凋亡作用，且其促凋亡作用呈浓度依赖性。 本研究结果显示，与A、C组相比，培养6、12、24、36、48 h时B组细胞增殖抑制率升高，细胞凋亡率升高，CDX2、BCR-ABL mRNA及蛋白相对表达量降低。提示通过转染CDX2-siRNA沉默K562细胞CDX2基因表达，能够明显抑制K562细胞增殖，这可能是通过转染CDX2-siRNA降低K562细胞CDX2和BCR-ABL表达，进而促进细胞凋亡导致的。BCR-ABL融合基因具有过高的酪氨酸激酶活性，是慢性髓细胞白血病发病的主要原因。本研究结果显示，转染CDX2-siRNA在沉默K562细胞CDX2基因表达的同时，也抑制BCR-ABL融合蛋白的表达低。因此由此推测，CDX2沉默表达引起细胞凋亡增加可能与下调BCR-ABL融合基因表达有关。已有研究发现在胃癌细胞中CDX2沉默表达会导致PTEN、Caspase-3 、Caspase-9 等细胞凋亡因子表达明显上调；而Cappellini 等[17]和Sherbakova 等[18，19]分别通过研究发现Caspase-3、PTEN基因过表达可抑制细胞内药物外排过程，加强抗肿瘤药物的效果。转染CDX2-siRNA后K562细胞CDX2和BCR-ABL融合蛋白表达下降进而导致Rh2外排受抑，这可能是转染CDX2-siRNA后K562细胞凋亡率和增殖抑制率升高的原因。

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R733.72

B

1002-266X(2016)47-0081-04

2016-04-27)