李运华　邬远林　黄红芬　丁卫江

(萍乡市卫生学校，江西　萍乡　337000)



苦参碱对Aβ25～35诱导认知功能障碍小鼠空间记忆和海马神经再生能力的影响

李运华邬远林黄红芬丁卫江1

(萍乡市卫生学校，江西萍乡337000)

摘要〔〕目的探索苦参碱(Mat)对Aβ25～35诱导认知功能障碍小鼠空间记忆和海马神经再生能力的影响。方法采用向雄性ICR小鼠(25～30 g)侧脑室立体定向注射Aβ25～35诱导认知功能障碍模型，根据实验设计分为模型组、Mat低、中、高剂量组(每组20只)，选取同龄未处理的正常小鼠20只作对照(对照组)。Mat低、中、高剂量组分别于术后7 d每天灌胃30、60、100 mg/kg Mat，而模型组和对照组仅给予等体积生理盐水。治疗4 w后采用Morris水迷宫检测各组空间记忆水平(登台潜伏期、站台所在象限停留比例及游泳速度)；取各组小鼠的海马组织制备病理切片，分别采用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)染色和Hoechst 33258染色检测海马神经细胞的增殖和凋亡情况；制备海马组织匀浆液，检测各组的生长相关蛋白(GAP)-43水平(Western印迹法)和氧化应激相关指标(试剂盒检测)。结果与对照组比较，模型组训练3 d后的登台潜伏期延长，而Mat各处理组训练3 d后的登台潜伏期均短于模型组(P<0.05)；模型组的站台所在象限停留比例低于对照组(P<0.05)；Mat低、中、高剂量组的站台所在象限停留比例均高于模型组(P<0.05)；Mat可呈剂量依赖的方式缩短登台潜伏期及延长站台所在象限停留比例。与对照组相比，模型组的海马BrdU阳性细胞数、GAP-43蛋白含量及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性降低，Hoechst阳性细胞数和丙二醛(MDA)含量升高，且 Mat处理后可改善以上指标异常，且改善效应呈剂量依赖方式(P<0.05)。结论Mat可改善Aβ25～35诱导的认知功能障碍小鼠空间记忆和海马神经再生能力，对海马神经有保护效果，可能与其减轻氧化应激有关。

关键词〔〕认知功能障碍；苦参碱；空间记忆；海马神经再生

1南昌大学第二附属医院神经内科

第一作者：李运华(1965-)，男，高级讲师，主要从事神经系统疾病研究。

阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆的最常见病因，主要特征为渐进的神经退行性改变和脑内β淀粉样蛋白(Aβ)沉积〔1〕。AD的神经退行性病变与神经元减少及神经病变有关〔2〕。AD发生发展过程中伴有增强的氧化应激和过剩的自由基水平，且活性氧等自由基产生是介导AD发生发展中神经元死亡的主要因子〔3〕，提示改善氧化应激为改善AD学习记忆功能的可行策略。苦参碱(Mat)具有较好的抗氧化作用〔4，5〕及神经保护作用〔6〕。本研究给予Aβ25～35诱导的认知功能障碍小鼠Mat，观察对空间记忆和海马神经再生能力的影响。

1材料与方法

1.1实验动物及分组采用向雄性25～30 g ICR小鼠(北京维通利华公司)侧脑室立体定向注射Aβ25～35来诱导认知功能障碍模型，根据实验设计分为模型组、Mat低、中、高剂量组(每组20只)，选取同龄未处理的正常小鼠20只作对照(对照组)。Mat低、中、高剂量组分别于术后7 d每天灌胃30、60、100 mg/kg Mat治疗，而模型组和对照组仅给予等体积生理盐水。所有小鼠均饲养于SPF级环境，饲养室保持20°C、60%～70%湿度，12 h/12 h明暗周期饲养，可自由获取食、水。

1.2主要试剂与仪器Aβ25～35、溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和Hoechst 33258购自Sigma公司，Mat购自陕西省科学院西安植物园植物化学开发研究所(纯度为99.5%)，生长相关蛋白(GAP)-43多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究院，丙二醛(MDA)测定试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。51600型立体定位仪购自美国Stoelting 公司，Morris水迷宫购自中国医学科学院药物研究所，美国ELx800型全自动酶标仪购自Bio-TEK公司。

1.3动物模型制备将Aβ25～35溶于无菌生理盐水(2 μg/μl)，使用前于37℃孵育1 w，4℃保存备用。大鼠称重后采用腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)进行麻醉，将小鼠头部固定于立体定位仪，依次剪开小鼠头部皮肤、暴露颅骨和前囟，参照小鼠脑图谱，以前囟为零点，坐标为前囟后0.8 mm，右侧旁开1.4 mm，颅骨表面下3.7 mm，于颅骨上用牙钻打孔，微量进样器垂直进入右侧脑室后注入10 μl凝聚态Aβ25～35(注射时间为5 min)。对照组注射同体积的生理盐水，其余步骤一致。完成手术后，缝合皮肤并完成青霉素肌肉注射。

1.4空间记忆功能检测采用Morris水迷宫检测空间记忆功能，水迷宫为圆形水池(直径130 cm，高50 cm)，水温19℃～20℃，根据池壁上标的东南西北4个点将圆形水池分为右下、右上、左上、左下共4个象限，于右下象限正中设有平台，水面高于平台1.5 cm。均于治疗4 w后开始训练，历时6 d，训练时按右下、右上、左上、左下四个象限依次将小鼠面向池壁放入水中(训练时间为60 s)，记录潜伏期和游泳速度等指标。将平台撤去，记录60 s内大鼠为搜索平台而穿过原平台放置区域的时间与总游泳时间的比例。

1.5海马区新生细胞检测BrdU染色用于标记新生细胞。Aβ25～35注射24 h后，每天连续3次腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，4 w后采用4%多聚甲醛灌注固定，取出脑组织并制备海马部位冠状连续切片(厚约40 μm)，每5张脑片保留1张，常规处理后一抗4℃孵育24 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗片后，加入生物素标记的二抗(稀释比例1∶100)室温孵育30 min，DAB显色，将切片贴于载玻片上，用中性树胶封片。在200倍物镜下，计数海马区的BrdU阳性细胞数。

1.6海马区凋亡细胞检测取脑组织，制备厚约4 μm的海马部位冠状连续石蜡切片，脱蜡水化后加入0.5 ml 的Hoechst 33258染色液，5 min后滴加抗淬灭封片液，在350 nm激发波长下，采用荧光显微镜(40倍物镜)计数Hoechst阳性细胞数。

1.7海马组织GAP-43水平检测采用Western印迹法检测海马组织GAP-43的蛋白水平。快速收集海马组织后加入组织裂解液，研磨充分后制备匀浆，12 000 r/min离心20 min后，取上清采用lowry法测定蛋白浓度。每个样本取等量蛋白(20 μg)，行常规10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干法转膜后根据膜面积加入适量的GAP-43一抗(1∶200)，4℃孵育过夜加入二抗(1∶3 000)室温下摇荡孵育2 h。采用化学发光ECL显色后采用Gel-Pro analyzer软件分析各目的条带光密度，GAP-43相对表达量为其光密度与GAPDH的比值。

1.8氧化应激相关指标检测过量麻醉法处死小鼠后迅速取脑，置于液氮中至适当硬度，收集海马组织，于冰上研磨并裂解15 min；12 000 r/min离心20 min，收集上清并根据试剂盒说明书检测MDA含量及SOD和CAT活性。

1.9统计学分析采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析和LSD法检验。

2结果

2.1Mat处理对各组空间记忆水平的影响

2.1.1登台潜伏期各组训练1～2 d登台潜伏期无统计学意义(P>0.05)；与对照组比较，模型组训练3 d后的登台潜伏期延长，而Mat各处理组训练3 d后的登台潜伏期均短于模型组(P<0.05)；Mat高剂量组训练4～6 d后的登台潜伏期均短于Mat低剂量组和Mat中剂量组(P<0.05)。见表1。

组别1d2d3d4d5d6d对照组70.14±3.1254.23±2.7537.22±4.0524.82±1.8518.65±1.7217.37±2.06模型组72.37±4.2857.46±3.5253.96±2.641)42.31±3.231)38.79±2.281)35.25±2.241)Mat低剂量组69.25±3.4360.08±4.2647.23±3.461)2)37.28±2.291)2)34.26±1.661)2)30.63±1.721)2)Mat中剂量组71.48±2.2959.77±3.9843.17±3.111)2)3)35.63±3.431)2)31.28±2.421)2)3)27.58±1.951)2)3)Mat高剂量组68.63±1.6562.34±3.3442.61±2.421)2)3)30.24±2.621)2)3)4)26.35±2.811)2)3)4)22.19±2.181)2)3)4)

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与Mat低剂量组比较：3)P<0.05；与Mat中剂量组比较：4)P<0.05;下表同

2.1.2站台所在象限停留时间比例模型组的站台所在象限停留比例为(19.46±2.71)%，低于对照组的(34.55±4.37)%(P<0.05)；Mat低、中、高剂量组的站台所在象限停留比例依次为(23.24±3.20)%、(27.13±2.74)%和(32.09±3.69)%，均高于模型组(P<0.05)；且除Mat高剂量组外，其余Mat处理组仍低于对照组(P<0.05)；随着Mat剂量的升高，站台所在象限停留比例升高，改善效应呈剂量依赖的方式。

2.1.3游泳时间对照组、模型组、Mat低、中、Mat高剂量组的游泳速度依次为(11.82±3.06)、(12.37±3.47)、(12.71±3.80)、(11.72±1.46)、(12.53±3.32)cm/s，各组均无统计学差异(P>0.05)。

2.2Mat处理对各组海马神经细胞增殖的影响模型组的BrdU阳性细胞数为(13.31±1.74)个/mm2，低于对照组的(33.84±2.92)个/mm2(P<0.05)；Mat低、中、高剂量组的BrdU阳性细胞数依次为(18.55±0.93)、(24.93±1.26)和(32.62±2.07)个/mm2，均高于模型组，且呈剂量依赖的方式升高(P<0.05)。见图1。

2.3Mat处理对各组海马神经细胞凋亡的影响模型组的Hoechst阳性细胞为(12.33±2.69)个/mm2，高于对照组的(5.46±0.78)个/mm2(P<0.05)；Mat低、中、高剂量组的Hoechst阳性细胞数依次为(9.32±1.38)、(8.90±1.24)和(6.73±0.92)个/mm2，均高于模型组，且呈剂量依赖的方式降低(P<0.05)。见图2。

2.4Mat处理对各组海马GAP-43水平的影响模型组GAP-43的蛋白相对表达量为(0.29±0.03)，低于对照组的(0.76±0.06)(P<0.05)；Mat低、中、高剂量组的GAP-43的蛋白相对表达量依次为(0.46±0.04)、(0.53±0.05)和(0.62±0.03)，均高于模型组，呈剂量依赖的方式升高(P<0.05)。见图3。

图1　各组海马区域的BrdU染色图(×200)

图2　各组海马区域的Hoechst染色图(×200)

A：对照组；B：模型组；C：Mat低剂量组；D：Mat中剂量组；E：Mat高剂量组图3　各组海马区域GAP-43的Western印迹原始图

2.5Mat处理对各组海马氧化应激相关指标的影响模型组的MDA水平高于对照组，但SOD和CAT活性均低于对照组(P<0.05)；Mat低、中、高剂量组的以上指标均优于模型组，改善效应均其呈剂量依赖性(P<0.05)。见表2。

组别MDA(nmol/ml)SOD(U/ml)CAT(U/ml)对照组0.42±0.1210.32±1.268.74±0.99模型组1.34±0.251)3.27±0.721)2.13±0.851)Mat低剂量组1.19±0.231)2)5.34±0.661)2)4.62±0.741)2)Mat中剂量组0.82±0.171)2)3)6.69±1.231)2)3)5.32±0.591)2)3)Mat高剂量组0.68±0.191)2)3)4)8.47±1.281)2)3)4)6.45±1.321)2)3)4)

3讨论

在AD早期即可发生氧化应激反应，如在AD患者脑部可检测到蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸的氧化产物〔7，8〕。脑比其他器官消耗更多的氧，且脑部对活性氧自由基的耐受较差〔9〕，故积极控制脑部氧化应激水平对脑部神经保护有重要意义。Mat是从豆根槐属植物苦参中分离出来的生物碱，已被证实具有显著的抗氧化作用，唐美岸等〔4〕发现Mat可改善肺纤维化大鼠肺线粒体的氧化应激，周茹等〔5〕发现Mat可通过抑制氧化应激发挥对实验性银屑病小鼠的保护作用。此外，包桂兰等〔10〕发现Mat的衍生物对局灶性脑缺血大鼠氧化应激反应有较强的干预作用。以上证据表明Mat的抗氧化应激作用显著。

学习和记忆为脑的高级整合功能，作为认识和记忆的基础，其与空间学习能力减退、衰老密切相关〔11〕。本研究结果提示认知功能障碍小鼠的模型制备成功，其空间记忆能力受损，Mat可以显著改善Aβ毒性导致的空间记忆障碍，且Aβ处理对小鼠的运动功能无影响，同时也排除运动功能差异对水迷宫实验结果的影响，使本研究设计及结果更加科学有效。

学习和记忆的神经基础为中枢神经系统的可塑性，突触连接是神经可塑性的关键部位，也是神经元之间信息传递的重要环节〔12，13〕。海马神经元减少是AD发生发展中的主要病理改变，当受损神经细胞未被新生神经细胞替代时，即可影响空间记忆障碍〔14〕。海马神经元数目在维持学习和记忆功能稳定上发挥重要作用，提示海马神经元的再生情况是评价治疗效果的有利指标。高浓度Aβ25～35短肽段具有神经毒性作用，可导致神经细胞有凋亡，而Mat处理后Hoechst阳性反应细胞减少，表明Mat可抑制Aβ25～35导致的新生神经元的凋亡。

GAP-43已广泛用于评价神经元生长发育和神经可塑性〔15〕。本研究进一步表明Mat对海马部位神经细胞有保护作用，可逆转Aβ25～35诱导的氧化应激。降低氧化水平可能是Mat发挥改善认知功能障碍小鼠空间记忆和海马神经再生能力的基础。

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〔2015-03-27修回〕

(编辑滕欣航)

中图分类号〔〕R749〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7030-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.028