杨　锋　潘　乐　马秋涛　张　涛　杨利学　李彦民

(陕西中医药大学附属医院骨科，陕西　咸阳　712083)



右归丸对骨髓间充质干细胞成脂分化相关基因甲基化的影响

杨锋潘乐马秋涛张涛杨利学李彦民

(陕西中医药大学附属医院骨科，陕西咸阳712083)

摘要〔〕目的探讨右归丸含药血清对骨髓间充质干细胞成脂分化相关基因表达及其甲基化影响。方法制备右归丸含药血清备用。无菌条件下，取SD大鼠骨髓间充质干细胞，贴壁法培养，传代。第二代贴壁细胞分组：(1)对照组：用含10%盐水的DMEM培养；(2)成脂诱导组：用成脂诱导条件培养基培养；(3)右归丸组：10%右归丸含药血清加成脂诱导条件培养基；分别干预3 d后用RT-PCR及甲基化特异性PCR法检测PPARγ和C/EBPα基因表达和甲基化状态。结果右归丸组PPARγ和C/EBPα的表达明显低于其他各组(P<0.05)。右归丸组PPARγ和C/EBPα甲基化上调，组间比较差异显著(P<0.05)。结论右归丸含药血清可通过去甲基化的表观遗传调控机制抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。

关键词〔〕补肾药；骨髓间充质干细胞；成脂分化；甲基化

第一作者：杨锋(1977-)，男，副教授，博士，硕士生导师，主要从事中医药防治骨与关节退行性疾病研究。

DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰途径之一，可造成基因的失活。表观遗传修饰是在核苷酸序列不发生改变的情况下，通过甲基化、乙酰化等手段最终导致可遗传的表型变化〔1〕。骨髓间充质干细胞(BMSCs)中DNA序列没有改变，但是可以分化成不同功能的细胞。表观遗传调控BMSCs分化已经成为科学研究的热点和前沿领域〔2，3〕。本文通过研究补肾名方右归丸对BMSCs成脂分化相关基因甲基化的影响，旨在一定程度上阐明中医“肾主骨、生髓”理论的科学内涵。

1材料与方法

1.1动物、仪器及试剂选4周龄SD大鼠，清洁级，体质量(180±20)g，雌雄各半，饲养于陕西中医学院实验中心饲养室，实验大鼠均由西安交通大学医学院实验动物中心提供。许可证号：SCXK(陕)2012-003。CO2细胞培养箱(德国Heraeus)，AE21倒置显微镜(Olympus)，流式细胞仪(Bechman Epicx)，荧光定量PCR仪(美国ABI 7300)，紫外分光光度仪UV-2300，台式高速离心机(Eppendorf)，基因组DNA抽提试剂盒(QIAGEN)，甲基化修饰试剂盒(QIAGEN)，PCR试剂盒(上海捷兰)，随机引物(华大基因)。

1.2方法

1.2.1中药含药血清的制备右归丸处方组成：熟地24 g、山萸肉9 g、枸杞子9 g、当归9 g、菟丝子12 g、鹿角胶12 g、山药12 g、杜仲12 g、附子6 g、肉桂6 g。分别加水煎制，并根据“人与动物体表面积折算等效剂量比率表”计算临床等效剂量，2次/d，灌胃给药，1 ml/次，连续灌胃3 d，第3天下午灌胃后1 h，给予大鼠麻醉后经腹主动脉采血、1 500 r/min 10 min离心后抽滤、56℃灭活、-20℃冻存备用。

1.2.2实验分组对照组：L-DMEM，10%胎牛血清，1%青、链霉素。成脂诱导组：L-DMEM，20%空白血清，1%青、链霉素，成脂诱导剂(10～6 mol/L地塞米松，0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，100 μmol/L吲哚美辛，胰岛素10 mg/L)。右归丸组：成脂诱导培养液加10%右归丸含药血清。

1.2.3BMSCs的分离、培养SD大鼠经腹腔氯胺酮麻醉后处死，75%酒精浸泡5 min，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨，咬骨钳修剪骨端，暴露髓腔，5 ml注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培养基反复冲洗髓腔，直到骨质外观微微透亮。10 cm培养皿收集骨髓冲洗液，37℃、5%CO2孵箱培养。每3 d换液1次。第4 代培养细胞进行流式细胞仪检测，结果显示细胞均一性较好，其中CD34、CD45表达呈阴性，而CD90 、CD105 表达呈阳性，阳性率分别为93.136%和93.182%，提示培养所得细胞为主要是BMSCs，非造血性细胞。用细胞计数板作有核细胞计数，调整细胞浓度为5×104/ml，以备实验之用。

1.2.4RT-PCR 检测成脂及成脂相关基因表达诱导分化第14天，按照试剂盒说明提取各组细胞总RNA，反转录及实时荧光定量PCR检测PPARγ、C/EBPα的mRNA表达。各基因引物序列：GAPDH正义：5′-AATGATCCGTTGTGGATCTGA-3′，反义：5′-CCTGCTTCACCACCTTCT-3′；PPARγ正义：5′-CCAGAAAG CGATTCCTTCAC-3′，反义：5′-CACGTTAGTTTCACCTCGGA-3′；C/EBPα正义：5′-AAGAAGTCGGTGGACAAGAACAG-3′，反义：5′-TGCGCACCGCGATGT-3′。按RT-PCR Kit说明书操作。反应条件：(1)37℃逆转录30 min；(2)94℃灭活RNA酶2 min；(3)94℃解链30 s；(4)55℃退火30 s；(5)72℃延伸45 s；(6)第(3)～(5)步再重复30次；(7)72℃延伸7 min。

1.2.5甲基化特异性 PCR(MSP)法检测相关基因甲基化状态按照试剂盒说明提取各组细胞DNA，加入亚硫酸盐混合液修饰，纯化，PCR反应。甲基化引物由Methyl Primer Express v1.0设计，由华大基因合成，引物序列：PPARγ-甲基化(M)正义：TTGGAAAGTCGTATTTTGATAGGAC，反义：CGAACCAAATTACTTAAACGATCAC；PPARγ-非甲基化(NM)正义：GGTTGGAAAGTTGTATTTTGATAGGAT，反义：CAAACCAAATTACTTAAACAATCACCA；C/EBPα-M正义：TTAAAGGAGGGGCGTTTAATTAC，反义：CCACTAACTCCTACGCTACTAAACG；C/EBPα-NM

正义：TTTAAAGGAGGGGTGTTTAATTAT，反义：CCCACTAACTCCTACACTACTAAACA。PCR产物电泳条件：TBE缓冲液，1.2%的琼脂糖，电压180 V，电泳时间50 min。用天能GIS1600凝胶成像系统分析净光密度，求甲基化率〔M光密度/(M光密度+NM光密度)〕。

1.3统计方法应用SPSS19.0软件，计量资料用单因素方差分析或非参数方法检验。两样本率的比较用χ2检验。

2结果

RT-PCR检测发现，右归丸组的PPARγ和C/EBPα表达明显高于其他各组(P<0.05)。干预14d后，甲基化电泳显示，右归丸组甲基化率低于其他各组(P<0.05)。见表1，图1，图2。

组别基因表达PPARγC/EBPα基因甲基化率PPARγC/EBPα对照组1.00±0.451.00±0.5518.6610.97成脂诱导组0.92±0.272.80±0.2125.0917.09右归丸组0.56±0.231)0.63±0.361)34.501)18.661)

与对照组比较：1)P<0.05

图1　PPARγ甲基化电泳图

图2　C/EBPα甲基化电泳图

3讨论

“肾主骨”、“肾生骨髓”见于《素问·宣明五气篇》。其病理、生理含义为：肾中精气充盈，则骨髓生化有源，骨才能得到骨髓更好的滋养，骨骼才会强健有力。肾气衰微，肾精虚少，骨髓化生乏源，不能营养骨骼，则骨髓空虚，发为骨痿。骨质疏松属于骨痿范畴。

现代医学研究显示〔4,5〕，骨质疏松患者BMSCs的成骨分化能力明显下调，成脂分化方向的能力明显增强。BMSCs分化失衡，偏向成脂方向分化，所以产生了骨形成的减少与骨髓中脂肪组织的增加，这是骨质疏松、骨坏死等疾病的主要形成原因之一，也与中医骨痿的病理机制——“骨髓空虚”有着某种意义上的契合。如何降低BMSCs成脂分化过程中相关基因表达将开辟骨质疏松等代谢性骨疾病新的思路。干细胞具有先天之精的属性，肾所藏之精可相应于胚胎干细胞以及其他成体干细胞(如：骨髓间充质干细胞等)〔6〕。中医在“肾藏精” 理论指导下的补肾药物能否调控骨髓间充质干细胞的成脂分化正是本研究的主旨所在。右归丸出自张景岳的《景岳全书·新方八阵》，为补肾填精的名方。具有温补肾阳，填精补髓之功效。故本研究选择右归丸作为补肾法的研究切入点。

表观遗传机制在干细胞定向分化中起着重要的作用。其中，DNA甲基化是基因转录水平表观遗传学调控的主要方式，其在干细胞分化过程中起着重要的作用。DNA甲基化等表观遗传修饰是一种不涉及序列改变的基因表达调控方式，指DNA在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶。甲基化达到一定程度时会DNA结构收缩，螺旋加深，而不利于转录的起始，导致基因失活。相反地，去甲基化则可上调基因表达。

PPARγ通过调节相关基因的表达，在脂肪形成、糖脂代谢，以及在免疫系统中发挥重要作用，是脂肪细胞分化过程中的关键因子〔7〕。C/EBPα也是干细胞向脂肪细胞分化过程中起重要作用的转录因子之一。脂肪细胞特异性表达基因调控区内的增强子CCAAT重复序列的位点突变后，这些基因的调控区就不能诱导成脂相关基因的表达。而抑制C/EBPα的表达则可激活Wnt/β-Catenin信号通路刺激成骨相关转录因子而促进成骨〔8〕。本研究有效证明了补肾中药具有抑制BMSCs脂向转化的功能。PPARγ和C/EBPα甲基化上调，右归丸组优于其他各组，其甲基化的水平直接影响着成脂化的发展变化。本实验研究结果表明补肾中药右归丸含药血清可以明显增高PPARγ和C/EBPα基因甲基化的水平。

综上所述，右归丸干预BMSCs成脂过程中PPARγ和C/EBPα基因表达明显下调，且其DNA甲基化水平增高。一定程度上说明补肾中药右归丸可以通过上调成脂基因甲基化率，抑制基因的表达，逆转骨髓间充质干细胞向成脂方向分化，从抑制骨髓脂肪化来达到治疗骨质疏松的目的，为中医“肾主骨、生髓”理论的深入研究探索了新的思路。

参考文献4

1Riddihough G，Zahn LM.Epigenetics.What is epigenetics? Introduction〔J〕.Science，2010；330(6004)：611.

2Bibikova M，Laurent LC，Ren B，etal.Unraveling epigenetic regulation in embryonic stem cells〔J〕.Cell Stem Cell，2008；2(2)：123-34.

3Thomas D，Kansara M.Epigenetic modifications in osteogenic differentiation and transformation〔J〕.J Cell Biochem,2006;98(4):757-69.

4Fan QM，Tang TT，Zhang XL.The role ofCCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)α in osteogenesis of C3H10T1/2 cells induced by BMP-2〔J〕.J Cell Mol Med,2009；13(8B)：2489-505.

5Fux C，Mitta B，Kramer BP，etal.Dual regulated expression of C/EBP-alpha and BMP-2 enables differential differentiation of C2C12 cells into adipocytes and osteoblasts〔J〕.Nucleic Acids Res,2004；32(1)：e1.

6何丽娟，宋囡，何文智，等.左、右归丸通过TGF-β1信号途径对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014;34(11)：6382-4.

7张昭亮.C/EBPα基因启动子DNA超甲基化对与PPARγ相关的HDAC1抑制解除作用〔J〕.中国矫形外科杂志，2013；21(17)：1761-6.

8Sakura A，Komaki M，Rudnicki M.Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic，osteogenic，and adipogenic differentiation〔J〕.Differentiation，2001；68(4-5)：245-53.

〔2015-01-30修回〕

(编辑袁左鸣)

Effect of Yougui Pill(YGP)on gene methylation related adipogenesis differentiation of mysenchymal stem cells

YANG Feng,PAN Le,MA Qiu-Tao,etal.

The Affiliated Hospital of Shaanxi University of TCM,Xi'an 712083,Shaanxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of serum contained Yougui pill for adipogenic marker and methylation.MethodsUnder aseptic condition,bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from the femur and tibia of SD rats.The second generation of adherent cells were divided into normal control,bone induction,Yougui pill groups.PPARγand C/EBPα gene expressions and methylation status were measured by RT-PCR and methylation specific PCR assay after 1 days.ResultsPPARγand C/EBPαmRNA expressions of Yougui pill group were obviously lower than those of other groups(P<0.05).The methylations of PPARγand C/EBPαwere up-regulated(P<0.05).ConclusionsThe serum containing Yougui pills could inhibit adipogensis differentiating of bone marrow mesenchymal stem cells by demethylation mechanism.

【Key words】Kidney tonic formula;Yougui pill;BMSCs;Adipogenesis;Methylation

基金项目：国家自然科学基金项目(81102610，81473711)；陕西省中医管理局科研课题(13-JC014)；陕西省科技研究发展计划(2015SF072)

中图分类号〔〕R2-03〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-6979-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.006