包长春，赵 永，陈永胜，4* ，罗 蕊，黄凤兰，4，李国瑞，4，邢 超，李 跃，孙华军

(1.内蒙民族大学农学院，内蒙古通辽 028024;2.内蒙古通辽市土壤肥料工作站，内蒙古通辽 028024;3.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028024;4.内蒙古自治区高校蓖麻产业研究中心，内蒙古通辽 028024)

时间和空间复杂且准确的配合是所有生物遗传表达、发育的基础。时间和空间编码基因表达的方向主要受基因控制，通过一些特殊的序列包括顺式作用元件和反式作用因子调控实现。然而越来越多的证据表明生物发育过程中还涉及到表观遗传规律的调控。有丝分裂和减数分裂是可遗传的且与植物的生长发育存在密切联系，它能够可逆地改变基因的表达但不会改变DNA的序列。5-甲基胞嘧啶是一个显著的表观遗传修饰，它可以建立和维护多个相互作用的细胞机制。DNA甲基化在高等真核生物中的主要作用是作为基因防御系统去保护基因组内源性DNA和病毒入侵。此外胞嘧啶甲基化能保护基因组的完整性，同时在植物基因组的表达和抗环境压力方面有一定的作用。研究表明胞嘧啶甲基化在调节特定组织的基因表达扮演着重要的角色。如在植物发育过程春化处理和染色体印记，都发现在转录水平上存在复杂的表观遗传规律。

1 胞嘧啶甲基化在植物基因组的分布

脊椎动物核中胞嘧啶甲基化的水平为3% ～8%;植物中是6%～30%。在一些生物包括动物、植物、真菌中还发现，对称的二核苷酸GC胞嘧啶甲基化参与生物进化过程中保守的DNA修饰。动物和植物的甲基化水平存在显著不同，植物的甲基化主要发生在GC上，但动物的甲基化总是发生在CHG(H包括A C T)和对非称的CHH等位点。模式生物拟南芥中，大部分甲基化的基因组成串联或者反向串联，转座子分散重复，在甲基化基因组的内部或者着丝粒区域含量丰富，因此植物甲基化呈钳合性质。与动物的形成对比，动物的呈现连续的模式。所有表达的基因约5%的甲基化在激活子和33%的甲基化在转录区。胞嘧啶甲基化远离基因两端，这样被甲基化区域的既不在3'端也不在5'端。研究还表明，拟南芥总的基因组CG、CHG和CHH，甲基化的水平分别是 24% 、6.7% 和 1.7%［1］。

2 植物中胞嘧啶甲基化的建立和维护

DNA甲基化在高等植物中主要通过2个不同的互补的酶“从头合成”和“维持”DNA甲基化转移酶结合DNA脱甲基酶、组蛋白修饰酶以及染色体重组和RNA干扰技术来调控。“从头合成”甲基化是一个过程，以前未甲基化胞嘧啶残基被甲基化，导致形成新的甲基化模式。植物DNA的甲基化转移酶根据线性区域分为四大类 (MET1，CMT，DRM和Dnmt2)。在拟南芥中所有序列甲基化的建立全部依赖“从头合成”甲基化转移酶，它们的功能是通过RNA指导DNA甲基化调控模式的路径［2］。在拟南芥突变体缺少MET1转录激活的转座子和假基因驻留在异染色质区域，近60%的甲基化区域成为去甲基化。这些数据都为MET1介导的胞嘧啶甲基化的结论奠定基础，主要负责植物基因组中的异染色质区域的沉默。CGH甲基化主要是通过特定染色体甲基化酶、组蛋白甲基转移酶，和在某些特定位点是通过CMT3和DRM2控制的。CMT3的功能很可能在其他植物中非常保守。如与玉米CMT同源的ZMET2和ZMET5在维持CHG甲基化过程中起着重要的作用。

3 植物中胞嘧啶甲基化

直观上看，胞嘧啶甲基化方式的消除可以通过被动或主动地去甲基化来实现。在DNA复制时期，当在主动的去甲基化过程中被DNA糖基化酶(DME和ROS1)标记的甲基标记被去除，被动去甲基化的胞嘧啶被未甲基化胞嘧啶所代替［3］。DME在雌性配子中，有独特的表达方式。DME(二甲醚)在亲本染色体印记的调控中只有雌性的DME是种子发育过程中必不可少的。二甲醚的作用是通过去甲基化的启动子激活MEA基因的母体(雌性)等位基因来实现的。这将导致在2个活性母体复制和一个被印记的父体的MEA基因复制，从而防止胚乳过度增殖。最近研究表明，在雌性配子通过视网膜母细胞瘤途径进入合子的过程，MET1介导的DNA去甲基化得以实现。在配子时期，MET1的表达可以视网膜母细胞瘤RBR1和及其相互作用蛋白所抑制。在植物组织中，这种抑制作用引起了雌性的等位基因去甲基化［4］。

4 甲基化与基因表达的关系

在植物发育过程中调控转录的精确分子机制尚不清晰。研究表明，胞嘧啶甲基化基因表达的调节可以通过在基因组中基因本身的甲基化和/或其他位置的甲基化，可以调节目标基因本身离它的距离。研究甲基化周期和甲基化在大麦胚乳发育过程中的作用，结果显示高的甲基化可以抑制编码蛋白的基因。分析拟南芥的甲基化作用发现其基因甲基化作用普遍存在。约1/3的拟南芥基因被甲基化［5］。实际上，发现胞嘧啶甲基化是基因表达转录区域的一个重要部分，通常被甲基化的基因与未被甲基化的基因相比转录水平低。基因自身的甲基化作用不能阻止基因表达，但能影响基因的表达水平。在植物中，甲基化的区域通常阻碍转录，但甲基化在编码区域通常不影响基因表达，或者影响很少［6］。甲基化的胞嘧啶可以与甲基结合结构域的蛋白相联系，可以作用于不同种类的染色质修饰来形成蛋白质。

5 植物生长过程中胞嘧啶甲基化的重要性

植物中尽管胞嘧啶甲基化作为基因组的防御系统来维持基因组的完整，对植物生长发育的影响仍不清楚［7］。胞嘧啶甲基化作用于反义的MET1拟南芥植物表现出大量突出的表型，包括减少顶端优势、改变开花时间、丰富花的异常和卷曲的叶子。相似的，西红柿反义MET1植物也表现出相似的表型，表明胞嘧啶甲基化有多效的影响，影响很多涉及在植物发育中的基因。在植物发育过程中提高基因组甲基化，能够达到抗逆境的效果，因此推断甲基化可能与植物抗逆境存在一定的联系。DNA甲基化与植物的生长发育存在一定的联系。DNA甲基化可以影响植物开花，花形成的基因表达。植物在进行有丝和减数分裂过程中，甲基化能够改变DNA的构象使其无法正常与相应的蛋白结合，从而使非编码区无表达活性。非甲基化的启动子可以使编码区基因转录表达。去甲基化可以激活沉默的启动子，出现异常表达。对去甲基化的研究发现，在植物发育过程中会出现组织特异性，为了维持这种特异性，与特异性相关的基因表达，与之不相关的基因不表达，以此认为去甲基化可能与基因活化有关。研究发现低温处理可以降低甲基化水平，开花基因表达。这种现象有可能是春化的作用机理。Baurens等［8］对马占相思的全基因进行甲基化水平检测，结果表明幼嫩叶片的微芽甲基化程度为22.4%，成熟叶片微芽的甲基化程度为20.7%［9］。对植物的甲基化研究发现成年植株的甲基化水平，比幼年甲基化水平高。这与Baurens等［8］的结果相反，即DNA甲基化与植株的衰老存在一定联系但并非一定成正相关。

6 植物发育过程中胞嘧啶甲基化的动态

在哺乳动物个体发育过程中，具有表观遗传标记的消失和重建，表现出细胞特定类型的胞嘧啶甲基化模式［10］。在植物中，没有明确的证据证明通过发育使表观遗传状态复位，除甲基化的胞嘧啶在胚乳中显著减少，然而，胚乳始终末分化［11］。相反，在对几种植物的甲基化研究表明，稳定的胞嘧啶甲基化水平和模式在多代中稳定遗传。对植物的基因组印迹研究表明，主要通过DNA糖基化酶活性去除甲基化的胞嘧啶，而不是通过基因组主动去甲基化的胞嘧啶。在整个植物生长发育中，胞嘧啶甲基化和基因沉默存在更密切的联系，DNA甲基化发生在转录水平，分为转录前沉默和转录后沉默。研究表明无论甲基化发生在转录前还是转录后引起的基因沉默都与启动子的甲基化程度有关，一般启动子区域的超甲基化会引起基因沉默［12］。并不是所有的底甲基化序列都可以被再甲基化，而事实上，甲基化基因产生的siRNA，取决于RdDM通路，因此siRNA能够选择性地促进甲基化作用的不足进而来加强沉默。具有组织特异性差异的甲基化区域(TDMS)已经确定其参与哺乳动物发育和组织/器官的分化。据估计，5%或以上CpG在哺乳动物中是TDM，与CpG都是未甲基化的这一说法相违背，TDM在老鼠和人类中较保守，这表示甲基化在调节组织细胞特异的基因表达之间的区别中有一定作用。在不同组织中的研究表明，组织特异的DNA甲基化与组织特异的转录有很大关系。在植物中相似的系统的研究尚了解，但一些研究可以在不同植物组织中比较整体体现的甲基化水平和差异。早期的研究，通过HPLC在不成熟的西红柿组织(茎、叶、根)中来判断甲基化的水平，结果表明，成熟的叶比茎和根的甲基化水平低。在植物中甲基化水平随植物的发育而改变，在衰老的组织中可以检测到较高的甲基化水平，据推测这种改变的趋势在得到的结论是在衰老期的胞嘧啶甲基化是为防止DNA的减少。另外，通过用MSAP(甲基化敏感扩增多态性)分析拟南芥中基因组区域，在几个器官中，包括子叶、叶、花中特异的甲基化被被检测到。于此同时在玉米的秧苗和成熟的植株中存在特异的甲基化。在植物发育过程中与胞嘧啶甲基化的动态性相一致，在不同组织器官发育时期，甲基转移酶编码基因的表达也具有动态性。如Dai等研究了5种基因编码的小麦 DNA甲基转移酶，MTases(TaMET1，TaMET2a，TaMET2b，TaCMT和TaMET3)，发现虽然他们都在发育中的种子，发芽的种子和各种营养组织中表达，但在转录程度变化显著。然而，这并不意味着在植物发育时期DNA转移酶基因特异的时间空间表达与DNA甲基化的改变相关联［13］。最近研究表明，关于在发育过程中水稻基因组完全的胞嘧啶甲基化位置和不同的组织胞嘧啶甲基化水平与DNA甲基转移酶活性无关。因此认为不同的DNA转移酶活性与组织/器官和发育阶段甲基化水平没有直接的相关性。

7 展望

目前对于木本植物甲基化的研究比草本相对少。虽然拟南芥的全基因组甲基化图谱已经公布。随着甲基化深入的研究仍有许多问题，对甲基化作用维持的机制尚不清晰，甲基化引起的一些生物学现象尚不明确。因此应该对生物信息学进行深入研究，期望验证甲基化的功能。总之对甲基化的研究将有助于揭示其在动植物生长发育过程中发挥的作用。

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