陈 羽， 徐 威

(沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016)



苯扎溴铵与艾叶水提物的协同杀菌效果

陈 羽， 徐 威*

(沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016)

采用悬液定量杀菌试验，对苯扎溴铵与艾叶水提物的协同杀菌效果进行了实验室研究。研究发现，0.1%苯扎溴铵与艾叶水提物混合溶液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、白假丝酵母菌和黑曲霉均呈现出显著的协同杀菌作用。结果表明，苯扎溴铵与艾叶水提物具有良好的协同杀菌效果。

苯扎溴铵；艾叶；悬液定量杀菌试验；协同杀菌

苯扎溴铵(商品名:新洁尔灭)是一种季胺盐类阳离子表面活性剂，其溶液无色、无臭，有轻微刺激性，能吸附于细菌表面，改变胞壁通透性，使菌体内的酶、辅酶和代谢中间产物逸出，呈现杀菌作用。苯扎溴铵对许多芽胞型致病菌、革兰阳性菌及霉菌具有很强的广谱杀菌作用，但对革兰阴性杆菌及肠道病毒作用却较弱[1]。艾叶系菊科植物艾(ArtemisiaargyiLevl. et Vant)的干燥叶，外用具有治疗皮肤瘙痒的功效。文献报道[2], 艾叶水煎液具有抗细菌和真菌作用, 尤其是对引起妇科阴道炎症的葡萄球菌、铜绿假单胞菌等具有显著的抑制作用。本文对苯扎溴铵与艾叶水提物的协同杀菌效果进行了实验室研究，为药厂合理开发新型中药与化学药复配消毒剂新产品提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、大肠埃希菌(EscherichiacoliATCC 8099)、枯草芽胞杆菌(BacillussubtilisATCC 9372)、白假丝酵母菌(CanidiaalbicansATCC 10231)和黑曲霉(AspergilliusnigerATCC 16404)由沈阳药科大学微生物学与细胞生物学教研室提供。

1.1.2 培养基(g/L) 营养肉汤培养基：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，氯化钠5.0；营养肉汤琼脂培养基：在营养肉汤培养基中加入琼脂粉14.0；沙堡琼脂培养基：葡萄糖40.0，蛋白胨10.0，琼脂粉14.0。

1.1.3 缓冲液(g/L) 磷酸盐缓冲液：无水磷酸氢二钠2.83，磷酸二氢钾1.36，pH 7.2；中和剂：硫代硫酸钠2.0，溶解于磷酸盐缓冲液中，起中和消毒剂的杀菌作用。

1.1.4 消毒液的制备 取0.1 g苯扎溴铵(沈阳红旗制药有限公司)，用无菌蒸馏水定容至100 mL，即0.1%苯扎溴铵消毒液。取艾叶(安徽亳州华夏药业有限公司)200 g, 加适量水煎煮3次, 煎煮时间分别为60、40和20 min，用8层纱布过滤, 合并滤液, 浓缩至500 mL，即艾叶水提液。取0.1 g苯扎溴铵，用艾叶水提液定容至100 mL，即复合消毒剂。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 试验菌为S.aureusATCC 6538、E.coliATCC 8099和C.albicansATCC 10231。取磷酸盐缓冲液5.0 mL加入新鲜斜面培养物试管内，反复吹吸，洗下菌苔。用移液管将洗液移至另一无菌试管中，用涡旋混合器振荡20 s，使菌体悬浮均匀。初步制成的菌悬液，先用比浊测定法测其含菌量，然后用磷酸盐缓冲液稀释至1×1011～5×1011cfu/L。菌悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。

实际浇筑过程中采用分层浇筑的方式，采用机械震捣手段完成，震捣过程中震捣仪的移动间距要适宜，捣震的过程中不得触碰相关的设备，如预埋件、钢筋等，采用不同的振捣方法，混凝土的浇筑厚度有所不同，具体如下：采用插入式震动，浇筑层厚度为振捣器作用部分长度的1.25倍；如果是表面震动，无筋或配筋稀疏结构的浇筑层厚度为25cm，配筋较密结构的浇筑层厚度为15cm；附着式震动的浇筑层厚度为30cm；入工捣固的浇筑层厚度为20cm

1.2.2 中和剂的考察试验 以S.aureusATCC 6538为试验菌，按悬液定量杀菌试验程序进行[3]。设平行6组试验，即：a组为消毒液+菌悬液；b组为(消毒液+菌悬液)+中和剂；c组为中和剂+菌悬液； d组为(消毒液+中和剂)+菌悬液；e组为磷酸盐缓冲液+菌悬液(正常菌对照)；f组为磷酸盐缓冲液+中和剂+培养基(阴性对照)。中和剂及其浓度的判定标准：a组不长菌或仅有极少数菌落生长；b组有菌落生长，较a组为多，但较c、d、e组为少；c、d、e组菌落数分别在1×108～5×109cfu/L内，且组间菌落数误差率不应超过15%；f组无菌生长。借此可判定所选中和剂及其浓度是否适宜。

1.2.3 芽胞悬液的制备 取已经活化3代的B.subtilisATCC 9372营养肉汤培养物3 mL，接种于罗氏瓶中营养肉汤琼脂培养基表面，置于37 ℃恒温培养箱内，培养8 d。采用孔雀绿法进行芽胞染色镜检。当芽胞形成率达95%以上时，即可进行悬液的制备。用无菌水30 mL轻轻推刮下菌苔，集中于一含玻璃珠的无菌三角瓶中，振摇30 min，分散培养物，使成均匀的悬液。将盛装上述悬液的三角瓶置于45 ℃水浴中24 h，使菌自溶断链，分散成单个芽胞。最后，将三角瓶放于80 ℃水浴中10 min，以杀灭残余的细菌繁殖体，待冷至室温后，即为芽胞悬液。

1.2.4 黑曲霉孢子悬液的制备 用接种环划线接种A.nigerATCC 16404于沙堡斜面培养基上，置28 ℃恒温培养箱中培养10 d。吸取0.05%吐温-80水溶液4 mL置于斜面表面, 刮洗分生孢子，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇30 min后，用脱脂棉花滤过除去菌丝体即为孢子悬液。

1.2.5 悬液定量杀菌试验 将装有5 mL消毒液的试管置于20 ℃水浴中5 min，再加入0.1 mL菌悬液，混匀，作用至规定时间(2、5、10、20 min)。取混和液0.5 mL，移入含有4.5 mL中和剂溶液的试管中，混匀，中和作用10 min。取0.1 mL涂平板，置恒温培养箱内培养，活菌计数。以内装5 mL标准硬水的试管同步操作所得活菌数为基准，计算杀菌率。

1.2.6 评价指标 协同系数(T/E)=各因子单独作用时微生物存活百分率乘积/多因子共同作用实测微生物存活百分率(其中，存活率为0时，按0.000 1%计算)。

T/E值为判断复合增效作用强弱的标准。T/E值小于1为拮抗作用，等于1为相加作用，大于1为增效作用，其值越大，增效作用越强[4]。

1.2.7 模拟现场试验 选择木质桌面，在桌面上划定5 cm×5 cm范围的4个不同区域，分别标记为基准区、苯扎溴铵区、艾叶提取物区和复合消毒剂区。以涂抹法污染E.coliATCC 8099悬液(菌数为1×107cfu/L)，待自然干燥后进行试验。消毒前，将无菌棉拭于5 mL磷酸盐缓冲液试管中沾湿，以涂抹法在基准区采样作基准；将0.1%苯扎溴铵、艾叶提取物及复合消毒剂分别均匀喷涂在各自所属区域，作用10 min，以同样方法消毒后采样。分别将消毒前后采样棉拭采样端剪入5 mL中和剂试管内,活菌计数，观察杀菌效果。

2 结果与分析

2.1 中和剂的考察

表1 消毒剂的中和剂试验结果

2.2 对金黄色葡萄球菌的协同杀菌作用

复合消毒剂对S.aureusATCC 6538的协同杀菌能力较苯扎溴铵和艾叶单独作用时强(表2)。经计算，复合消毒剂作用2 min时，T/E值为327.04，起到了显著的增效作用。

表2 对金黄色葡萄球菌的杀灭效果

2.3 对大肠埃希菌的协同杀菌作用

复合消毒剂对E.coliATCC 8099的协同杀菌能力较苯扎溴铵和艾叶单独作用时强(表3)。经计算，复合消毒剂作用2 min时，T/E值为11 307.44，起到了显著的增效作用。

表3 对大肠埃希菌的杀灭效果

2.4 对枯草芽胞杆菌的协同杀菌作用

复合消毒剂对B.subtilisATCC 9372的协同杀菌能力较苯扎溴铵和艾叶单独作用时强(表4)。经计算，复合消毒剂作用2 min时，T/E值为4.23，起到了显著的增效作用。

表4 对枯草芽胞杆菌的杀灭效果

2.5 对白假丝酵母菌的协同杀菌作用

复合消毒剂对C.albicansATCC 10231的协同杀菌能力较苯扎溴铵和艾叶单独作用时强(表5)。经计算，复合消毒剂作用2 min时，T/E值为3 723.85，起到了显著的增效作用。

表5 对白假丝酵母菌的杀灭效果

2.6 对黑曲霉的协同杀菌作用

复合消毒剂对A.nigerATCC 16404的协同杀菌能力较苯扎溴铵和艾叶单独作用时强(表6)。经计算，复合消毒剂作用2 min时，T/E值为3 436.4，起到了显著的增效作用。

表6 对黑曲霉的杀灭效果

2.7 模拟现场试验

用苯扎溴铵、艾叶水提物以及复合消毒剂进行模拟现场试验。试验结果表明：苯扎溴铵、艾叶水提物及复合消毒剂对E.coli8099悬液作用10 min，杀菌率分别为95.44%、91.46%和100%。说明该复合消毒剂具有明显的协同杀菌优势，为药厂开发新型艾叶复配消毒剂提供理论依据。

3 讨 论

目前生产、生活中使用的消毒剂主要是化学消毒剂，因其不同程度地存在药物残留、污染环境、产生抗药性等副作用，从而限制了它们的应用。从消毒剂发展趋势看，研制杀菌力强，抗菌谱广，对人毒副作用小，腐蚀性小，价格低廉的新型消毒剂仍然是今后的主攻方向。中草药消毒剂对环境无污染、无刺激性、无副作用，气味芳香，用来部分替代化学消毒剂，符合研制和开发环保新型消毒剂的发展趋势[5]。

本研究采用悬液定量杀菌试验，以协同系数T/E值作为评价指标，对苯扎溴铵与艾叶水提物的协同杀菌效果进行了实验室研究。结果表明，0.1%苯扎溴铵+艾叶水提物复合消毒剂协同作用可以克服单一消毒剂存在的不足，对某些细菌(S.aureusATCC 6538、E.coliATCC 8099和B.subtilisATCC 9372)、某些酵母菌和曲霉菌(C.albicansATCC 10231、A.nigerATCC 16404)均起到了显著的协同杀菌效果，为将来合理开发新型艾叶复配类消毒产品提供了理论依据。

[1] 雒晓芳，董开忠，王冬梅，等.新洁尔灭对三种细菌的抑菌效果研究[J].西北民族大学学报，2009，30(1)：64-66.

[2] 刘萍，刘巍，袁铭.艾叶和复方艾叶水提液体外抗菌作用比较[J].医药导报，2007，26(5)：484-485.

[3] 卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范[S].北京：中华人民共和国卫生部，2002：9-200.

[4] 聂绍发,朱贵宝,林天晖,等.新洁尔灭与戊二醛协同杀菌作用的实验研究[J].同济医科大学学报，2001，30(1)：50-52.

[5] 王金和，边传周，金登宇, 等.中草药消毒剂杀菌效果的研究[J].中国畜牧兽医，2010，37(11)：227-230.

Synergic Germicidal Efficacy of Bromogeramine and Aqueous Extract of Moxa Leaf

CHEN Yu， XU Wei

(Schl.ofLifeSci. &Biopharm.,ShenyangPharm.Univ.,Shenyang110016)

The synergic germicidal efficacy of bromogeramine combined with moxa leaf (Artemisiaargyi) aqueous extract was studied in laboratory. It was found that bromogeramine (0.1%) combined withArtemisiaargyiaqueous extract had obviously synergetic germicidal efficacy againstStaphyloccocusaureusATCC 6538,EscherichiacoliATCC 8099,BacillussubtilisATCC 9372,CandidaalbicansATCC 10231, andAspergilliusnigerATCC 16404. The results showed that bromogeramine combined withArtemisiaargyiaqueous extract had good synergetic germicidal efficacy.

bromogeramine; moxa leaf (Artemisiaargyi); suspension quantitative germicidal test; synergic germicidal efficacy

陈羽 男，硕士，讲师。主要从事微生物制药及消毒剂的杀菌消毒研究。E-mail:chenyu0208303@126.com

*通讯作者。女，博士，教授。主要从事微生物制药及微生物转化生物活性物质的研究。E-mail:gzweishengwu@126.com

2013-12-18；

2013-12-25

Q815

B

1005-7021(2015)01-0109-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.021