陈雨晴， 黄惠琴， 刘 敏， 鲍时翔*

(1.海南大学 环境与植物保护学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 海口 571101)



八门湾红树林土壤小单孢菌的分离及其多样性

陈雨晴1,2， 黄惠琴2， 刘 敏2， 鲍时翔2*

(1.海南大学 环境与植物保护学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 海口 571101)

采用平板稀释法从海南八门湾红树林潮间带、木果榄和海莲红树根际土壤样品中分离和筛选小单孢菌科放线菌，对其分离方法进行了评价和比较，并通过16S rRNA基因测序探索了八门湾红树林小单孢菌科放线菌的多样性。采用4种预处理方法和5种分离培养基，经过排除重复菌株后共得到115株放线菌。16S rRNA基因测序结果显示，这些放线菌分布在5个科、9个属。其中小单孢菌科的菌株约占全部菌株的90% (105株)，主要分布于3个属：Micromonospora(85%)，Jishengella(9.5%)和Verrucosispora(5.5%)，与其亲缘关系最近的菌株的相似性分布于98.5%～100%之间。

小单孢菌科；红树林； 多样性；分离方法

放线菌是提取天然产物和抗生素的重要来源，近年来链霉菌的过度开发导致新型化合物的发现愈加困难，微生物也逐渐出现抗药性变异，95%以上的活性物质被证明为重复开发[1]，因此，急需寻找新的药物来源来代替链霉菌。小单孢菌科( Micromonosporaceae ) 是一类具有多种生物活性的稀有放线菌，至2013年小单孢菌科内被公认的属共有27个[2]，是稀有放线菌中生产抗生素的最大来源[3]，小单孢菌科放线菌能产生特有的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤等效果的抗生素[4]。由于小单孢菌科放线菌具有生长缓慢、难分离等特点，其挖掘深度远远不如真菌和链霉菌，但是该类群在土壤、水体、湖海沉淀物和植物根际中广泛存在，具有广阔的发展前景。红树林是分布于热带和亚热带的特殊海岸潮间带生态系统，周期性受潮水侵蚀，并且具有高水分、高盐分、寡营养等特点，蕴含极为丰富且极具特色的微生物资源[5]，研究表明，红树林的微生物多样性优于其他生境[6]，是产次级代谢产物放线菌的重要来源[7]。本研究主要从海南八门湾红树林潮间带、木果榄和海莲红树根际采集土壤样品，使用多种针对小单孢菌科放线菌的有效分离方法，对小单孢菌科放线菌进行分离，并通过16S rRNA基因测序对可培养小单孢菌科放线菌的多样性进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品的采集 于2012年11月，从海南文昌八门湾红树林(19°22′～19°35′ N, 110°4′～110°48′ E)潮间带、海莲与木果榄2种红树群落的红树根际，按照五点采样法，分别采集0～5，5～10，10～20 cm深处土壤样品，均匀混合后装入无菌袋内，并置入冰盒中于4 h内带回实验室处理。

1.1.2 培养基 小单孢菌科放线菌分离培养基: HV，M1 (可溶性淀粉10 g，干酪素0.3 g，KNO32 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL, pH 7.2)，M7 (天冬氨酸0.1 g，蛋白胨2 g，丙酸钠4 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4)，土壤浸汁琼脂，几丁质琼脂，纯化培养基为ISP2。在分离培养基中均加入过滤除菌的100 μg/mL重铬酸钾、100 μg/mL放线菌酮、10 μg/mL萘啶酮酸，以抑制细菌和真菌的生长；培养基中以70%陈海水和30%蒸馏水代替原配方中100%蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理 土壤样品均采用5种预处理方法：干热(A)：土壤样品自然风干后120 ℃干热处理1 h；风干加苯酚(B)：土壤样品自然风干后加入1.5%苯酚，30 ℃水浴30 min[8]；风干加湿热(C)：土壤样品自然风干后55 ℃湿热处理6 min；湿热(D)：未风干土壤样品55 ℃湿热处理6 min。

1.2.2 放线菌分离 将1 g预处理后土壤样品稀释于10 mL无菌陈海水中，180 r/min震荡30 min，静置20 min后取上清液，采用平板稀释法稀释至10-2、10-3和10-4，各取100 μL涂布于分离培养基平板上，每个稀释度3次重复，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养4～8周，待长出明显菌落后，挑选形态特征不同于链霉菌的单菌落划线于ISP2培养基上直至菌株纯化。

1.2.3 16S rRNA测序与分析 采用核酸提取仪提取菌株基因组 DNA为模板，PCR扩增使用放线菌通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCMTGCCTCAG-3′)和1492r (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应条件：94 ℃ 5min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR反应产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程(上海)有限公司直接测序。测序结果经处理后提交至EzTaxon核酸序列库(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)进行比对，利用MEGA5.0软件进行多序列比对，Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 小单孢菌科放线菌的分离

采用选择性分离培养法及5种培养基共分离295株类似小单孢菌科放线菌菌株，经初步形态学排除重复菌株，筛选到115株放线菌，通过16S rRNA基因序列测定，105株属于小单孢菌科。分别统计4种预处理方式和5种培养基分离菌株的数量，不同的培养基和处理方法对分离小单孢菌科放线菌数量的影响见图1和图2。

由图1可知， HV培养基分离得到小单孢菌科放线菌的数量最多，约占总菌株数量的39%；M1和土壤浸汁琼脂分离效果相当，各占 24%和21%， M7培养基和几丁质琼脂培养基共分离得到16%的小单孢菌科放线菌菌株。

图1 培养基对分离小单孢菌科放线菌分离数量的影响Fig.1 Number of Micromonosporaceae strains isolated by different media

预处理方式也是影响菌株分离数量的一大因素。由图2可知，通过预处理C分离到小单孢菌科放线菌92株(占总数的88%)，是本实验中分离数量最多的预处理方法；预处理B和D分离菌株的数量较少，分别为3株和9株，而方法A仅得到1株小单孢菌科放线菌。

图2 预处理方法对分离小单孢菌科放线菌分离数量的影响Fig.2 Number of Micromonosporaceae strains isolated by different pre-treatment methods

A：风干加干热；B：风干加苯酚；C：风干加湿热；D：湿热

A：air drying and dry heat;B:air drying and wet-heating with phemol;

C:air drying and wet-heating;D:wet-heating

2.2 可培养小单孢菌科放线菌的多样性

将16S rRNA基因测序结果和数据库中菌株序列进行系统发育相似性的比对，初步鉴定分离所得115株放线菌分布在5个科(Thermomonospraceae、Geodermatophilaceae、Gordoniaceae、Streptosporangiaceae和Micromonosporaceae)、9个属(Actinomadura、Blastococcus、Rhodococcus、Nonomuraea、Microbiospora、Streptosporangium、Micromonospora、Jishengella和Verrucosispora)，其中小单孢菌科放线菌约占全部菌株的90% (约105株)，主要分布于3个属：Micromonospora(85%)、Jishengella(9.5%)和Verrucosispora(5.5%)。由此可见，以上3个属在八门湾红树林土壤可培养小单孢菌科放线菌中占主要优势；菌株的最大同源性分布于98.5%～100%之间，同源性小于99%的菌株约占全部菌株的29.5%(31株)。105株菌株的16S rRNA基因序列比对结果见表1。

表1 分离菌株与模式菌株的16S rRNA序列比对结果

分别在以上21个类群中选取代表序列，将序列上传至GenBank，登录号为KJ467023～KJ467043，根据序列同源性从高到低的顺序选取25株代表菌，利用Mega5.0软件构建系统发育树，见图3。

图3 基于16S rRNA的21株菌株与相关菌株的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 21 strains and related strains based on 16S rRNA

3 讨 论

目前小单孢菌科放线菌的传统分离方法主要以提供小单孢菌科放线菌适宜的生长条件和抑制快速增长的非目的菌为原则[9]，对土壤样品进行预处理目的是排除非目的菌干扰，同时最大程度地保留小单孢菌科放线菌。风干1～3周可有效减少细菌和链霉菌数量，并且小单孢菌科放线菌分离效果良好，但也会对部分种类造成影响；55 ℃湿热处理6 min有利于放线菌孢子萌发，分离菌株数量较多。培养基也是影响菌株分离的重要因素，其中碳、氮源是主要影响因素，如腐植酸、酪蛋白和几丁质等对包括小单孢菌科放线菌在内的稀有放线菌的生长具有促进作用[10]。根据本研究的结果，建议将HV、土壤浸汁和M1培养基混合使用，并且在土壤浸汁琼脂上由于营养较匮乏，菌株普遍生长缓慢，延长培养时间至8周能防止部分种类的遗漏。分离自几丁质培养基的菌株经初步鉴定，种类多为除小单孢菌科放线菌以外的稀有放线菌，可适用于非链霉菌资源的开发。通过改进方法，本研究与以前研究相比，能有效排除链霉菌的干扰，分离得到小单孢菌科放线菌的比例大幅增加，并且得到种类也比较丰富。

张晓敏[2]的研究表明小单孢菌科放线菌的分布趋向于温和、营养含量高并且具有适当湿度的条件，且部分小单孢菌属具有典型的地域分布特点。王成[11]对海南文昌头苑红树林的23种红树植物的根际土壤选择性分离并鉴定的30株小单孢菌科放线菌均属于Micromonospora，并分属于9个种。洪亮等[12]从海南清澜港、儋州、湛江、深圳等7处不同红树林土壤样品共分离得到127株小单孢菌科放线菌，主要属于Micromonospora、Actinoplanes和Verrucosispora三个属。本研究选择了八门湾红树林潮间带和2种主要红树根际土壤作为实验样品，分离的小单孢科放线菌主要分布于3个属：Micromonospora、Jishengella和Verrucosispora，Micromonospora在数量上显著高于小单孢菌科内其他属，并且在各地红树林生境中都占有一定的优势；而其他菌群则具有地域分布的特点，如分离于海南红树林老鼠簕(Acanthusillicifolius)根际底泥的Jishengella[13]可能为海南红树林中特有的优势菌群，广泛分布于海洋生境如海绵、海底沉积物和泥炭沼中的Verrucosispora[14]作为一种能产生多种抗生素的放线菌，在本实验分离的菌株中也占有一定优势。

现代放线菌分类以16S rRNA核苷酸序列分析为中心，一般来说，如果相似性在97%以下可以定为新种[15]。但在小单孢菌科中，菌株间相似性要高于其他放线菌，如Koch等[16]研究发现小单孢菌科中16S rRNA基因序列的相似性普遍在98%～99%之间，疣孢菌属(Verrucosispora)中VerrucosisporamarisDSM 45365(T)与VerrucosisporagifhornensisDSM 44337(T)之间的相似性更是高达99.7%[17]。本研究中相似性低于99%的菌株可被视为潜在新种，有待进一步验证。

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Isolation of Micromonosporaceae from Mangrove Soil in Bamen Bay & Its Diversity

CHEN Yu-qing1, 2, HUANG Hui-qin2, LIU Min2, BAO Shi-xiang2

(1.Envir. &PlantProtect.Coll.,HainanUni.,Haikou570228; 2.KeyLab．ofBiol. &GeneticRes．ofTropicalCrops,Minist.ofAgric.,Inst.ofTropicalBio-Sci. &Biotech.,CATAS;Haikou571101)

Micromonosporaceae actinomycetes were isolated and screened from soil samples collected from rhizospheric soil ofXylocarpusmekongensisandBruguierasexangulain Wenchang Bamen Bay of Hainan intertidal zone adopting dilution-plate method, and the isolation methods were valuated and compared, and the diversity of Micromonosporaceae actinomycetes in Bamen Bay mangrove forest were investigated with 16S rRNA gene sequencing. Four pre-treatment approaches and five isolation media were used, a total of 115 actinomycetes strains were obtained after removing the repetitive strains. The 16S rRNA gene sequencing results showed that these 115 actinomycetes belonged to 5 families and 9 genera. Among them Micromonosporaceae strains accounted for 90% of the total (105 strains), and mainly distributed in three genera:Micromonospora(85%),Jishengella(9.5%), andVerrucosispora(5.5%), and the similarities of the strain with the nearest osculation distributed from 98.5% to 100%.

Micromonosporaceae; mangrove; diversity; isolation method

国家支撑计划(2012BAC18B04)；国家海洋经济创新发展区域示范项目(厦海渔合2013-18号)；海南省重大科技项

陈雨晴 女，硕士研究生。研究方向为微生物资源与利用。E-mail:chenyuqingmz@126.com

* 通讯作者。男，研究员，博士生导师。研究方向为微生物资源与利用。Tel: 0898-66988564，E-mail:bsxitbb@ 163.com

2014-03-02；

2014-04-15

Q939.13+9；Q78

A

1005-7021(2015)01-0006-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.002

目(ZDZX2013023-1)