覃 冰， 姚迁会， 潘迎捷， 王永杰*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部 水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201306)



对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP110 N端结构特征、原核表达及检测

覃 冰1,2,3， 姚迁会1,2,3， 潘迎捷1,2,3， 王永杰1,2,3*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部 水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201306)

VP110为对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)的囊膜蛋白。相似性分析发现，VP110与昆虫DNA病毒经口感染关键因子PIF2具同源性，且同源区主要位于N端150～600aa。同时两者均在N端前端含一个跨膜区。为了研究VP110 N端保守区的功能，将vp110 N端基因(Svp110，450～1 830 bp)克隆至pET-16b及pGEX-4T1原核表达载体中，同时分别在大肠埃希菌BL21(DE3)、Rosetta 2菌株中优化表达条件，诱导VP110 N端蛋白(sVP110)表达。实验结果表明，重组质粒pET-16b-Svp110在37 ℃ 1 mmol/L IPTG条件下可得到表达，但16 ℃下表达量很低。而重组质粒pGEX-4T1-Svp110则在16 ℃下得到较高表达。同时，Rosetta 2 菌株的表达量高于BL21(DE3)。该研究表明Rosetta 2 菌株更适合作为WSSV结构蛋白的表达，同时VP110在不同载体中的表达受温度的影响。VP110 N端蛋白的表达为VP110的功能研究打下了基础。

对虾白斑综合征病毒(WSSV)；VP110；原核表达

白斑综合征病毒又称白点病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)，是一种不形成包涵体(occlusion body)、具囊膜、杆状的双链环状DNA病毒，属于Nimaviridae科Whispovirus属[1-4]，是导致对虾养殖亏损的最主要病源。至2013年，除澳洲外，WSSV已传播到全球的对虾养殖场所，严重威胁着对虾养殖业的可持续发展[5-7]。但因缺乏体外连续培养WSSV的对虾细胞系，WSSV的感染和致病机理研究进程缓慢，目前尚无有效防治其增殖和传播的办法。囊膜蛋白作为病毒的最外层结构，是病毒感染及致病力的一个重要因子。WSSV囊膜蛋白VP110自2004年被分离确定以来，其蛋白质功能尚未得到确认[8-9]。2006年，Li等[10]提出VP110 的RGD模体结构可能参与WSSV的感染过程。虽然WSSV基因与已知生物基因鲜有同源性，Wang等[11-12]通过基因组的深度比较分析发现，WSSV与昆虫DNA病毒的亲缘性较为明显。因此，在该研究基础上，将WSSV VP110做了更深入的功能分析。同时，根据分析结果，选取了同源性程度较高并涵盖RGD结构的VP110 N 端区域(Svp110，450～1 830 bp，共1 380 bp)，将其构建至pET-16b(6×his-tag)、pGEX-4T1(GST-tag)原核表达载体中。成功构建的重组质粒转化至BL21(DE3)及Rosetta 2两种大肠埃希菌后，分别在37和16 ℃下进行诱导表达，以优化sVP110融合蛋白的表达条件。VP110融合蛋白在不同表达菌株、不同诱导温度下表达条件的优化，将为WSSV及其他病毒的结构蛋白的原核表达提供一定的选择依据。同时，sVP110融合蛋白的获得，将可用于VP110抗体的制备以及蛋白功能的探究，有助于在一定程度上揭示WSSV的侵染机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒基因组 对虾白斑综合征病毒基因组由国家海洋局第三海洋研究所(厦门)提供，于-20 ℃保存。

1.1.2 质粒和试剂 pET-16b载体、Rosetta 2 菌株由台湾大学动物学研究所提供；pGEX-4T1载体为本实验贮存；BL21(DE3)、Top10菌株、DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、2×PCR Master Mix、IPTG和氨苄青霉素均购自天根生化科技(北京)有限公司；高保真TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、蛋白质预染maker、DNA maker、考马斯亮蓝R-250均购自Thermo公司；即用型蛋白质分子量标准(高)购自TaKaRa 公司；Rabbit anti-his 抗体、Goat anti-rabbit IgG(H+L)-AP 二抗、BCIP/NBT显色液均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；硝酸纤维膜及滤纸购自Whatman 公司。

1.2 方法

1.2.1 VP110同源性分析 在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上调取昆虫DNA病毒Baculoviruses、Nudiviruses、Hytrosaviruses最具代表种的经口感染关键因子PIF2蛋白序列，采用EMBL-EBI网页(http://www.ebi.ac.uk/)中的Clustal Omega、T-coffee及MUSCLE序列分析软件对VP110(GenBank: NP_477557.1)和PIF2进行保守区分析。

1.2.2 PCR扩增vp110目的片段 根据GenBank上公布的WSSV中国大陆株(NC_003225.2)序列分别设计2对Svp110引物。第1对正向引物：GGAATTCCATATGATGGATAGATTGAGT(划线处为NdeI 酶切位点)；反向引物：CGGGATCCTTATGGCTCAATGTAAA(划线处为BamHI 酶切位点)。第2对正向引物：CGGGATCCATGGATAGATTGAGT(划线处为BamHI酶切位点)；反向引物：GCGTCGACTTATGGCTCAATGTAAA(划线处为SalI 酶切位点)。根据说明书要求，采用High Fidelity PCR Enzyme Mix (Thermo) 扩增目的片段。PCR反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，10 ℃保存，35个循环数。PCR产物命名为Svp110 (short sequence ofvp110) ，采用DNA纯化试剂盒纯化。1.2.3 重组质粒构建 根据说明书要求，将pET-16b载体、Svp110 PCR产物NdeI、BamHI双酶切，同时pGEX-4T1载体、Svp110 PCR产物BamHI、SalⅠ双酶切。DNA纯化试剂盒纯化回收酶切产物，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接。连接产物化学转化至TOP10感受态细胞，感受态细胞均匀涂布于含100 μg/mL的氨苄青霉素平板上。恒温箱中过夜培养，菌落PCR筛选阳性克隆。阳性克隆酶切鉴定并送至生工生物工程(上海)公司测序。

1.2.4 VP110 多肽抗体制备 利用在线软件BepiPred 1.0 Server及IEDB Analysis Resource对VP110进行抗原表位预测分析，选择并合成VP110多肽片段GEDPKPYCWS(280～288aa)免疫新西兰大白兔获取抗VP110多肽抗体。抗体的制备由上海佑隆生物科技有限公司完成。采用Western blotting 及ELISA等方法，验证抗体特异性和灵敏度。

1.2.5 sVP110融合蛋白表达检测 测序正确的重组质粒pET-16b-Svp110、pGEX-4T1-Svp110化学转化至BL21(DE3)和Rosetta 2 表达菌株。挑取单菌落过夜培养，按1∶100的接种量转接于新鲜LB培养基(含100 μg/mL氨苄青霉素)中，37 ℃培养至OD600≈0.5，加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG，37 ℃诱导表达3 h或16 ℃过夜诱导表达。诱导结束取200 μL菌液离心上SDS-PAGE、Western blot检测表达情况。同时，取2 mL菌液离心收集菌体，冰上超声破碎，离心取上清检测融合蛋白表达情况。

2 结果与分析

2.1 VP110同源性分析

WSSV VP110同源性分析结果显示，VP110与昆虫DNA病毒经口感染因子PIF2序列共享多个保守的氨基酸位点和特征多肽序列，且其同源区域主要位于VP110 N端150～600aa(图1)。同时，TMHMM Server v.2.0软件分析蛋白质跨膜区时发现，VP110、PIF2(Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus, AcMNPV)两者均在N端前50aa区域含有1个跨膜区(图2)。VP110的跨膜区位于23～45aa，PIF2的跨膜区位于5～22aa。两者跨膜区前端均位于膜内，跨膜之后的氨基酸则位于膜外。由于PIF2已被确认为昆虫DNA病毒经口感染关键因子[13-15]，因此推测VP110和PIF2很有可能进化自同一个古老病毒的蛋白，其主要功能是对宿主的识别并启动侵染，VP110作为WSSV经口侵染对虾必不可少的关键囊膜蛋白的可能性非常高。

图1 WSSV VP110和昆虫DNA病毒经口感染因子PIF2序列比对(T-coffee)

图2 WSSV VP110 (a) 和昆虫DNA病毒经口感染因子PIF2(b)蛋白质跨膜区分析(TMHMM Server v. 2.0)

红色线条为跨膜区域，蓝色线条为膜内部区域，粉色线条为膜外部区域；纵坐标为跨膜区的可能性百分比，横坐标为氨基酸的位置

Red color shows transmembrane region， blue color means inside part， pink color indicates the outside part； Y-axis indicates the probability of transmembrane， X-axis means the location of amino acids

2.2vp110目的片段扩增及重组质粒构建

WSSV囊膜蛋白vp110 目的基因Svp110(450～1 830 bp，共1 380 bp)经PCR扩增后上琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示Svp110分子量大小正确(图3a)。EcoRI 、NdeI 双酶切重组质粒pET-16b-Svp110，酶切后分子量大小与预期大小一致，分别为5 378、9 586、6 896和54 bp(图3b)。EcoRI、SalI双酶切重组质粒pGEX-4T1-Svp110，酶切后分子大小为5 596和689 bp，结果显示重组质粒构建成功(图3c)。为确保序列的正确性，经双酶切验证的重组质粒送至生工(上海)生物有限公司测序，测序结果显示Svp110序列正确。

图3 琼脂糖凝胶电泳检测图

M:DNA分子量标准(1 kb)；1:Svp110 PCR产物(1 380 bp)；2：pET-16b-Svp110EcoRI、NdeI 双酶切产物；3： pET-16b-Svp110重组质粒 (7 085 bp)；4：pGEX-4T1-Svp110EcoRI、SalI 双酶切产物；5：pGEX-4T1-Svp110重组质粒(6 349 bp)

M: DNA marker(1 kb); 1:Svp110 PCR product (1 380 bp); 2: pET-16b-Svp110EcoRI andNdeI double digestion products; 3: pET-16b-Svp110 recombinant plasmid (7 085 bp); 4: pGEX-4T1-Svp110EcoRI andSalI double digestion products; 5: pGEX-4T1-Svp110 recombinant plasmid(6 349 bp)

2.3 sVP110融合蛋白表达检测

2.3.1 sVP110-his 融合蛋白表达检测 pET-16b-Svp110分别转化BL21(DE3)、Rosetta 2表达菌株并诱导sVP110-his融合蛋白表达。SDS-PAGE检测发现，在BL21(DE3)表达菌株中，sVP110-his融合蛋白无论在16 ℃还是37 ℃的诱导表达条件下，其表达量均很低(图4a、b)。而在Rosetta 2 表达菌株中，虽然16 ℃诱导条件下sVP110-his的表达量也很低(图4c)，但在37 ℃下却得到较高的表达(图4d)。sVP110-his 融合蛋白理论分子量约为52 ku(sVP110约51 ku，his约1 ku)。Western blot 检测sVP110-his 在Rosetta 2 菌株 37 ℃的表达情况，结果显示VP110多肽抗体(图4e)及His-tag抗体(图4f)均证实了sVP110-his的表达。但其分子量大小较理论分子量大(约～57 ku)。这与蛋白的性质有关，蛋白质的PI等特性影响了其在SDS-PAGE上的迁移速率。同时，VP110实际分子量(110 ku)也较理论分子量(108 ku)大[8-9]。

2.3.2 sVP110-GST 融合蛋白表达检测 sVP110-GST 融合蛋白理论分子量约77 ku(sVP110约51 ku，GST约26 ku)。SDS-PAGE检测发现，在16及37 ℃的诱导条件下sVP110-GST 融合蛋白均得到表达(图 5a～d)。同时，相同诱导条件下，pGEX-4T1-Svp110在Rosetta 2菌株中的表达量(图5c、d)要明显高于BL21(DE3)菌株。此外，无论是在BL21(DE3)还是在Rosetta 2菌株中，sVP110-GST在16 ℃诱导条件下的表达量(图5a、c)要稍高于37 ℃(图 5b、d)。Western blot检测pGEX-4T1-Svp110在Rosetta 2菌株中的表达情况，结果显示VP110多克隆抗体确认了sVP110-GST 融合蛋白的表达(图5e、f)。

图4 sVP110-his表达检测

SDS-PAGE检测(a～d)：pET-16b-Svp110 BL21(DE3)菌株16 ℃(a)、37 ℃(b)表达检测；pET-16b-Svp110 Rosetta 2菌株16 ℃(c)、

37 ℃(d)表达检测; Western blot检测(e，f)pET-16b-Svp110 Rosetta 2菌株在37 ℃的表达情况：(e)VP110 抗体检测(VP110多肽抗体1∶5 000稀释，羊抗兔-IGg-AP二抗1∶5 000稀释)；(f)His抗体检测(His抗体1∶2 000稀释，羊抗兔-IGg-AP二抗1∶5 000稀释)；M:蛋白质分子标准；1:未诱导的pET-16b-Svp110总蛋白；2：诱导的pET-16b-Svp110总蛋白；3：诱导的pET-16b-Svp110上清蛋白；黑色箭头指示sVP110-his融合蛋白

SDS-PAGE detection(a～d): pET-16b-Svp110 BL21(DE3) strain 16 ℃(a)、37 ℃(b)expression detection；pET-16b-Svp110 Rosetta 2 strain 16 ℃(c)、37 ℃(d)expression detection; Western blot detection(e，f)of pET-16b-Svp110 Rosetta 2 strain at 37 ℃:(e)Detection with VP110 antibody(1∶5 000 diluted for firstly antibody，1∶5 000 diluted for secondly goat anti rabbit-IGg-AP antibody)；(f)Detection with His-tag antibody(1∶2 000 diluted for firstly antibody，1∶5 000 diluted for secondly goat anti rabbit-IGg-AP antibody)；M:Protein marker；1:Total protein of non-induced pET-16b-Svp110；2:Total protein of induced pET-16b-Svp110；3:Supernatant protein of induced pET-16b-Svp110. Arrows indicate sVP110-his fusion protein

图5 sVP110-GST表达检测

SDS-PAGE检测(a～d)：pGEX-4T1-Svp110 BL21(DE3)菌株16 ℃(a)、37 ℃(b)表达检测；pGEX-4T1-Svp110 Rosetta 2菌株16 ℃

(c)、37 ℃(d)表达检测; Western blot检测(e，f)pGEX-4T1-Svp110 Rosetta 2菌株表达情况：(e)16 ℃诱导条件下sVP110-GST表达检测；(f)37 ℃诱导条件下sVP110-GST表达检测(VP110多肽抗体1∶5 000稀释，羊抗兔-IGg-AP二抗1∶5 000稀释)；M:蛋白质分子标准；1:未诱导的pGEX-4T1-Svp110总蛋白；2：诱导的pGEX-4T1-Svp110总蛋白；3：诱导的pGEX-4T1-Svp110上清蛋白；黑色箭头指示sVP110-GST融合蛋白

SDS-PAGE detection(a～d): pGEX-4T1-Svp110 BL21(DE3) strain 16 ℃(a)、37 ℃(b)expression detection；pGEX-4T1-Svp110 Rosetta 2 strain 16 ℃(c)、37 ℃(d)expression detection; Western blot detection(e，f)of pGEX-4T1-Svp110 Rosetta 2:(e)sVP110-GST expression detection under 16 ℃；(f)sVP110-GST expression detection under 37 ℃(1∶5 000 diluted for VP110 antibody，1∶5 000 diluted for secondly goat anti rabbit-IGg-AP antibody)；M:Protein marker；1:Total protein of non-induced pGEX-4T1-Svp110；2:Total protein of induced pGEX-4T1-Svp110；3:Supernatant protein of induced pGEX-4T1-Svp110； Arrows indicate sVP110-GST fusion protein

3 讨 论

对虾白斑综合征病毒自1992首次发现以来，给全球的渔业养殖经济造成了巨大的损失。目前，由于受缺乏可供离体培养WSSV的细胞系等方面的限制，WSSV研究进程缓慢，其绝大多数结构蛋白的功能是未知的。然而，了解和认识WSSV囊膜结构蛋白的功能，特别是在WSSV早期感染对虾过程中发挥决定性作用的囊膜蛋白，如经口侵染相关的识别、黏附、侵入蛋白，是揭示WSSV与宿主相互作用机理的核心。

VP110自分离确定以来，其功能都未得到揭示，其中原因主要有两方面：一是VP110为大分子量蛋白(110 ku)，采用常规的原核表达方式获取VP110全长蛋白较为困难[10]；二是前人的研究中发现VP110与已知生物蛋白鲜有同源性，无法推测其可能行使的功能。根据Wang等[15-16]提出的WSSV与昆虫DNA病毒(Baculoviruses、Nudiviruses和Hytrosaviruses)具一定的亲缘性理论，采用氨基酸序列比对软件(Clustal Omega、T-coffee及MUSCLE)对VP110进行同源性分析。比对结果发现，VP110与昆虫DNA病毒经口感染关键因子PIF2共享多个保守的氨基酸位点和特征多肽序列(图1)。此外，VP110、PIF2均在N端前50aa区域含一个跨膜区(图2)。因此，推测VP110和PIF2可能进化自同一个古老病毒的蛋白，其主要功能是对宿主的识别并启动侵染。

sVP110融合蛋白的诱导表达过程中，发现不同表达菌株及不同表达温度均对其表达量产生很大的影响。BL21(DE3)是原核表达首选的常用菌株，但其在合成外源蛋白时持有密码子偏好性，使pET-16b-Svp110在该菌株的表达量很低，且以包涵体的形式表达(图4a、b)。Rosetta 2补充了大肠埃希菌缺乏的7种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA及CGG)对应的 tRNA，提高了含多种稀有密码子的sVP110-his的总体表达水平(图4c、d)。同时，GST标签(可增加蛋白水溶性)的存在也使得pGEX-4T1-Svp110在BL21(DE3)中的表达量高于pET-16b-Svp110(图5a、b)。

低温条件使菌体代谢变慢，从而促进菌体内蛋白质正常加工折叠，是获取蛋白质水溶性的一种方式。然而，多次重复试验后(n>3)，发现在BL21(DE3)、Rosetta 2 菌株中，16 ℃低温条件不仅未提高pET-16b-Svp110的可溶性表达，还降低了其总表达量(图4a、c)。相反，pGEX-4T1-Svp110则在16 ℃低温下获得较高表达(图5a、c)。由此可见，外源蛋白在不同表达载体的表达受到诱导温度的影响。由于16 ℃低温条件以及GST标签的帮助均未促进sVP110-GST可溶性表达，推测在大肠埃希菌体内sVP110融合蛋白之间存在较多的疏水性作用力。后期可采用包涵体复性的方式获取有活性的sVP110融合蛋白。Western blot 检测结果发现pET-16b-Svp110表达出的sVP110-his有部分降解现象(图4e)，该现象并不影响sVP110-his融合蛋白的纯化及VP110抗体的制备。此外，研究中还涉及了不同IPTG浓度对sVP110-his、sVP110-GST表达的影响，但研究结果表明不同IPTG浓度对这两种融合蛋白及其可溶性的表达均不明显(数据未在此文中显示)。

VP110融合蛋白在大肠埃希菌中表达条件的优化，为WSSV及其他病毒结构蛋白的原核表达提供一定的选择依据。VP110与昆虫DNA病毒经口感染关键因子PIF2的同源性关系，为VP110功能研究指明了方向。后期研究的侧重点则探讨VP110是否为WSSV的经口感染关键因子，从而在此基础上增进对WSSV侵染分子机制的认识，并为进一步探索WSSV的起源及与其他病毒间的进化和亲缘关系提供实验依据。同时，还可根据关键囊膜蛋白的特点和作用机理，最终设计出相应的疫苗或阻断药物，实现有效阻断WSSV感染和传播。

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N-Terminal Structure Characteristic, Prokaryotic Expression & Determination of Envelope Protein VP110 of Prawn’s White Spot Syndrome Virus

QIN Bing1, 2, 3, YAO Qian-hui1, 2, 3, PAN Ying-jie1, 2, 3, WANG Yong-jie1, 2, 3

(1.Coll.ofFoodSci. &Technol.,ShanghaiOceanUni.,Shanghai, 201306; 2.ShanghaiEngin.Res.Ctr.ofAqua.-Prod.Process. &Preserv’n,Shanghai, 201306; 3.Lab.ofQual. &SafetyRiskAssessm’tforAquaticProduct’nonStor. &Preserv’n(Shanghai),Min.ofAgric.,Shanghai, 201306)

VP110 is an envelope protein of prawn white spot syndrome virus (WSSV). Similarity analysis found that VP110 possessed homology to oral infection factor PIF2 in insect DNA viruses, and its homologic region located in N-terminal 150aa to 600aa. Meanwhile, both of them have a transmembrane region at the leading end of N-terminal. To figure out if VP110 N-terminal conserved region played a crucial role in WSSV infection, N-terminal fraction ofvp110 gene (Svp110, 450～1 830 bp) was cloned into pET-16b and pGEX-4T1 prokaryotic expression systems. Moreover, both BL21 (DE3) and Rosetta 2E.coliexpression strains were selected for optimizing the expression conditions, to induce VP 110 N-terminal protein (sVP110) to express. The results indicated that recombinant pET-16b-Svp110 can be expressed under the condition of 37 ℃ and 1 mmol/L IPTG but showed lower expression level at 16 ℃. However, recombinant pGEX-4T1-Svp110 revealed higher expression level at 16 ℃. Furthermore, the expression level of Rosetta 2 strain was higher than that of BL21 (DE3). This result showed that Rosetta 2 strain was more suitable for WSSV structural protein expression. Moreover, the expression of VP110 in different vector was affected by temperature. And the expression of VP110 N-terminal protein lay a foundation for VP110 functional study to come.

white spot syndrome virus (WSSV); VP110; prokaryotic expression

教育部高等学校博士点基金项目(20133104110006)；上海市教委项目(14ZZ144)；上海市科委工程中心建设项目

覃冰 女，硕士研究生。主要从事水产病毒分子生物学研究。E-mail: qin2bing1@163.com

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。主要从事昆虫病毒及海洋微生物方面的研究。E-mail: yjwang@shou.edu.cn

2014-04-07；

2014-05-15

Q786；S945.4

A

1005-7021(2015)01-0012-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.003

(11DZ2280300)