转化生长因子-β1和阿托伐他汀对人心房成纤维细胞Ⅰ型胶原和Smads蛋白表达的影响

2015-12-16程显禄黄琦磊张建成

中国循环杂志 2015年6期

程显禄，黄琦磊，张建成

程显禄，黄琦磊，张建成

目的: 通过转化生长因子-β1（TGF-β1）和阿托伐他汀对培养的人心房成纤维细胞进行干预，观察其Ⅰ型胶原，Smad2、Smad4和Smad7 mRNA及蛋白表达的变化，探讨心房纤维化和抗纤维化机制。

方法: 通过心外科手术获得患者右心耳组织，并培养出人心房成纤维细胞；将细胞传代培养，应用四唑盐比色（MTT）法检测不同浓度（0、0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/ml）TGF-β1和不同浓度（0、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L）阿托伐他汀对心房成纤维细胞生长影响；应用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹杂交（Western blot）技术检测10.0 ng/ml TGF-β1、10.0 μmol/L阿托伐他汀以及10.0 ng/ml TGF-β1+10.0 μmol/L阿托伐他汀联合对心房成纤维细胞中Ⅰ型胶原，P-Smad2，Smad4和Smad7 mRNA和蛋白表达的变化。

结果: MTT法检测示：与对照（0 ng/ml）比，1.0 ng/ml 和10.0 ng/ml TGF-β1干预使心房成纤维细胞Ⅰ型胶原、P-Smad2、Smad4的mRNA和蛋白表达水平增高（P＜0.05），而Smad7的mRNA和蛋白表达水平减低（P＜0.05），差异均有统计学意义；与10.0 ng/ml TGF-β1相比，TGF-β1加用或单用阿托伐他汀（10.0 μmol/L）心房成纤维细胞Ⅰ型胶原、P-Smad2、Smad4的mRNA和蛋白表达水平减低（P＜0.05），而Smad7 mRNA和蛋白表达水平增高（P＜0.05），差异均有统计学意义。

结论： TGF-β1促进心房成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原表达，阿托伐他汀抑制其增殖和Ⅰ型胶原表达，可能是通过影响TGF-β1/Smads途径起作用。

心血管病学；心房颤动；心房成纤维细胞；转化生长因子-β1；Smads蛋白；阿托伐他汀

Methods: Human right atrial appendage tissue was obtained from the cardiac surgery in our hospital and the atrial fibroblasts were isolated and cultured by generations. The effects of TGF-β1 and atorvastatin on atrial fibroblast proliferation was detected by MTT method and the effect of TGF-β1 at (0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0) ng/ml and atorvastatin at (0, 0.1, 1.0, 10.0, 100.0) μmol/L on mRNA and protein expressions of collagen type I P-Smad2, Smad4 and Smad7 in atrial fibroblasts were examined by RT-PCR and Western-blotting analysis respectively.

Results: MTT detection presented that compared to TGF-β1 at 0 ng/ml, with the intervention of TGF-β1 at (1 and 10) ng/ ml, the mRNA and protein expressions of collagen type I P-Smad2, Smad4 increased, P＜0.05 and the expressions of Smad7 decreased, P＜0.05. Compared to TGF-β1 at 10.0 ng/ml, with the intervention of TGF-β1 + atorvastatin at 10.0 μmol/L or with atorvastatin at 10.0 μmol/L alone, the mRNA and protein expressions of collagen type I P-Smad2, Smad4 decreased, P＜0.05

and expressions of Smad7 increased, P＜0.05.

Conclusion: TGF-β1 promotes human atrial fibroblast proliferation and collagen type I expression, while atorvastatin inhibits such proliferation and expression, the effect might be done by affecting TGF-β1/Smads pathway in human atrial fibroblasts.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:562.)

以往研究表明心房颤动（房颤）发生和维持的基础是心房纤维化[1]。分子生物学研究亦表明，心房纤维化的中心环节是转化生长因子β1（TGF-β1）[2]，并通过TGF-β1/Smads信号传导通路使成纤维细胞增殖，胶原分泌增多，导致心房纤维化。Smad蛋白最早于果蝇中发现的Mad（Mothers against decapentaplegic）蛋白，而后又发现新杆状线虫体内的蛋白SMA也有相同功能，因此Ruiz-Ortega等[3]建议将参与TGF-β1细胞内信号传导的，人和不同动物的相关信号蛋白统一命名为Smad信号蛋白家族，它是TGF-β1受体作用的直接底物，它是把配体与受体相互作用的信号由细胞质转导到细胞核中的中间分子；分3个亚家族：第一类调节型Smad蛋白，包括Smad2等，需要磷酸化才能被激活；第二类是共同调节型Smad蛋白，只有Smad4，它与磷酸化（P-）Smad2发生结合，参与TGF-β1信号转导调节；第三类是抑制型Smad蛋白，包括Smad7等，它的功能是阻断Smad2被磷酸化，阻断信号的传导。另他汀类药物除调脂作用外，还有抗纤维化作用[4]。因此，了解心房纤维化的发生的机制和防治心房纤维化对治疗房颤有重要意义，笔者以人工合成TGF-β1诱导体外培养心房成纤维细胞的分化增殖和阿托伐他汀干预后，观察心房成纤维细胞增殖，I型胶原mRNA和蛋白表达的变化，同时观察P-Smad2，smad4，smad7 mRNA和蛋白表达变化，以探讨TGF-β1和阿托伐他汀对心房纤维化影响及可能机制。

1 资料与方法

资料：经医院伦理委会员批准和患者家属同意，心脏手术中在建立体外循环前，无菌下取右心耳组织块，并培养出人心房成纤维细胞作为研究对象；TGF-β1（美国peprotech公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）粉（上海华蓝化学科技有限公司），二甲基亚砜（DMSO，上海紫一试剂厂），酶联免疫检测仪（南京德铁）。

方法：按文献[5]方法，运用组织块法培养出人心房成纤维细胞， MTT法检测不同浓度TGF-β1（0、0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/ml）和不同浓度阿托伐他汀（0、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L）对心房成纤维细胞增殖的浓度效应，使细胞同步化，按实验方案分别加入含TGF-β1和阿托伐他汀的5%胎牛血清DMEM高糖培养液；每个浓度设5个复孔，并设对照，每孔200 μl，培养48 h；以上药物浓度为培养液中最终浓度。弃去原来的培养液，再加MTT的培养液，每孔加20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h后，每孔加入150 μl DMSO，置摇床上低速振荡10 min，在酶联免疫检测仪吸光值490 nm处测量各孔的吸光值，每孔重复测吸光值3次，取均值。同时设置调零孔，对照孔。再根据MTT法结果提示，选择合适药物浓度观察TGFβ1与阿托伐他汀联合对人心房成纤维细胞的增殖效应。

半定量逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）心房成纤维细胞培养到3～5代，使细胞同步化，按实验分不同浓度方案分别加入药物；药物干预48 h后用Trizol一步法提取RNA，经RNA质量鉴定和完整性鉴定后进行逆转录反应：按照TOYOBO公司“Rever Tra-α-”试剂盒说明进行：逆转录反应条件：30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃5 min，瞬间离心；cDNA产物放置-70℃低温冰箱中保存；引物的设计和合成：Smad2（273 bp）:上游 5’TCCACCAGGCTGTAATCTGAAGA 3’，下游5’GACATGCTTGAGCAACGCACT 3’；Smad4（376 bp）:上游 5’GATTTGCGTCAGTGTCATCG 3'，下游 5' TGATAAGGTTAAGGGCCCCA 3'；Smad7（289 bp）：上游 5’GAGTCAGCTGGTGCAGAAGGT 3’，下游5’GCCCTTCACAAAGCTGATCTG 3’；I型胶原（347 bp）：上游 5’GGCGGCCAGGGCTCCGAC 3’，下游 5’AATTCCTGGTCTGGGTCACC 3；内照GAPDH（451 bp）：上游 5’CCACAGTCCATGCCATCACT 3’，下游 5’TCCACCACCCTGTTGCTGTAG 3’；引物由TaKaRa（日本）公司合成。 PCR反应体系按

照TIANGEN公司的PCR MIX试剂盒说明进行配置。PCR反应条件：PCR反应体系于PCR管中混匀共25 μl，于PCR仪中进行PCR反应，94℃预变性3 min，然后进行PCR循环，94℃变性30 s，退火30 s，不同的目标基因退火温度分别为58℃[Smad2，Smad4，I型胶原，3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）]，57℃（Smad7），72℃延伸30 s，进行32次循环，结束前72℃延伸5 min。其中所有的目标基因均设置阴性对照，以去离子水代替cDNA产物进行的PCR反应。电泳和图像扫描：取各目的基因PCR产物3 μl和GAPDH 3 μl同时加入用2%琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色，用凝胶成像系统扫描，将目的基因条带与GAPDH灰度值对比，以两者的比值表示目的基因相对表达含量。

蛋白免疫印迹杂交（Western blot）法：心肌成纤维细胞同步化，按实验方案分别加入药物干预，48 h后进行Western blot实验。细胞蛋白提取后，存放于-70℃低温冰箱中保存。将样品沸水浴中煮5 min；经SDS-PAGE电泳转移至硝酸纤维素膜上，室温下封闭1 h，加一抗4℃过夜。兔抗人P-Smad2单克隆抗体（美国，SATANCRUZ），鼠抗人Smad4单克隆抗体（美国，Thermo scientific），兔抗人Smad7单克隆抗体（美国，SATANCRUZ），鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体（美国，Chemicon millipore），鼠抗人β肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（美国，SATANCRUZ）；转膜完成后以下实验按一步法免疫印迹试剂盒（UniversalTMOne-step Western Blot Kits）说明进行实验。X光片感光显影，凝胶成像系统测定蛋白样品条带的总灰度值。

2 结果

TGF-β1对人心房成纤维细胞增殖影响（表1）：TGF-β1对心房成纤维细胞生长增殖的最小有效浓度为1 ng/ml，且随着TGF-β1浓度增加吸光度值也增加，与对照（0.0 ng/ml）相比，除0.1 ng/ml浓度外，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml三个浓度间比较促进心房成纤维细胞增殖的吸光度值有增加的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），表明在细胞培养液中TGF-β1浓度为10 ng/ml时对体外培养的心房成纤维细胞达到了最大的增殖效应。

阿托伐他汀对人心房成纤维细胞增殖影响（表1）：阿托伐他汀对心房成纤维细胞生长抑制最小有效浓度为1.0 μmol/L，随阿托伐他汀浓度增加吸光度值在下降，和对照（0.0 μmol/L）相比除0.1 μmol/L外差异均有统计学意义（P＜0.05）；浓度100.0 μmol/L比10.0 μmol/L 吸光度值低，但差异无统计学意义（P＞0.05），表明在细胞培养液中10.0 μmol/L阿托伐他汀对体外培养的人心房成纤维细胞的抑制作用达到最大的效应。

表1 不同浓度TGF-β1、阿托伐他汀对人心房成纤维细胞增殖效应的影响

注：TGF-β1：转化生长因子-β1。两种药物和各自对照相比*P＜0.05。*心房成纤维细胞增殖效应的吸光度值

阿托伐他汀对TGF-β1诱导的人心房成纤维细胞增殖的影响（表2）：阿托伐他汀和TGF-β1不同浓度干预后和对照相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；10 μmol/L阿托伐他汀与10 ng/ml TGF-β1间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；10 ng/mlTGF-β1+10 μmol/L阿托伐他汀联合干预后与单纯10 μmol/L阿托伐他汀及单纯10 ng/ml TGF-β1比差异有统计学意义（P＜0.05），说明阿托伐他汀可部分对抗TGF-β1对人心房成纤维细胞的增殖效应。

表2 阿托伐他汀对TGF-β1诱导的人心房成纤维细胞增殖的影响

注：与对照相比*P＜0.05 ；与10 ng/ml TGF-β1相比△P＜0.05 ；与10μmol/L阿托伐他汀及10 ng/ml TGF-β1比▲P＜0.05。缩略语注释见表1

TGFβ1和阿托伐他汀对人心房成纤维细胞P-Smad2，Smad4，Smad7和Ⅰ型胶原mRNA水平的影响（图1A～1D、表3）：与对照（0）比，不同药物浓度TGF-β1及阿托伐他汀干预后P-Smad2、Smad4、Smad7、Ⅰ型胶原mRNA差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与10 ng/ml TGF-β1相比10 ng/ml TGF-β 1+10μmol/L阿托伐他汀及10 μmol/L阿托伐他汀干预后P-Smad2、Smad4、Smad7和Ⅰ型胶原的mRNA差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

Western blot 分析TGF-β1和阿托伐他汀对人心房成纤维细胞P-Smad2，Smad4，Smad7和Ⅰ型胶原蛋白水平的影响（表4和图2）。

图1 不同药物浓度人心房成纤维细胞P-Smad2、Smad4、Smad7和Ⅰ型胶原mRNA表达的电泳图

表3 TGF-β1和阿托伐他汀对人心房成纤维细胞P-Smad2、Smad4、Smad7和Ⅰ型胶原mRNA水平的影响

注：表中所列数据为内参校正后mRNA灰度值。与对照相比*P＜0.05；与10 ng/ml TGFβ1比△P＜0.05。缩略语注释见表1

表4 TGF-β1和阿托伐他汀对人心房成纤维细胞P-Smad2、,Smad4、Smad7、Ⅰ型胶原蛋白水平的影响

注：表中所列数据为内参校正后蛋白吸光度值。与对照相比*P＜0.05；与10 ng/ml TGF-β1比△P＜0.05。缩略语注释见表1

图2 不同药物浓度对P-Smad2、Smad4、Smad7、Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹杂交图

与对照比，不同药物浓度TGF-β1及阿托伐他汀干预后P-Smad2、Smad4、Smad7蛋白、Ⅰ型胶原蛋白表达水平差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与10 ng/ml TGF-β1相比，10 ng/ml TGF-β1+10 μmol/L阿托伐他汀及10 μmol/L阿托伐他汀干预后，P-Smad2、Smad4及Ⅰ型胶原吸光度值均降低，而Smad7吸光度值则升高，其蛋白表达水平差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

3 讨论

有研究认为房颤的发生、发展和维持与心房纤维化密切相关，心房纤维化主要是心房中Ⅰ型胶原mRNA转录水平上调以及蛋白表达水平增加，最终导致心房中胶原比例失调，心房重构[6]。

本研究表明，TGF-β1使人心房成纤维细胞中Ⅰ型胶原表达增高，这与Nakajima等[7]在实验中发现，TGF-β1表达增加的小鼠心房纤维化加重的结果相似；在体外培养人心房成纤维细胞中，与Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达增高同时，P-Smad2，Smad4 mRNA以及蛋白表达也增高，然而Smad7 mRNA和蛋白表达却减低；这与大鼠心梗组织中TGF-β1 mRNA增高时，P-Smad2和Smad4的mRNA在梗死组织亦增高，而Smad7的mRNA则减低结果相同[8]。实验还发现阿托伐他汀可部分拮抗TGF-β1诱导的人心房成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原表达的作用。且与对照相比，阿托伐他汀干预在Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达明显降低的同时，P-Smad2，Smad4 mRNA以及蛋白表达也明显减低；而Smad7的mRNA以及蛋白表达却增高，这与Wang等[9]报道的使Smad7表达增加可使I型胶原的表达明显受到抑制相一致；与 Martin等[10]在实验中抑制TGF-β1信号传导通路，使糖尿病大鼠心肌纤维化改善，并发现P-Smad2表达下降的结果相似。同时与另一研究提示，阿托伐他汀使高血压大鼠的心室重构改善是通过下调心肌P-Smad2、Smad4的mRNA和上调心肌Smad7的mRNA得已实现的结果相似[11]。

综上所述，TGF-β1可能是通过TGF-β1/ Smads途径，使胶原基因启动子位点被激活，增加I型胶原蛋白的表达；阿托伐他汀可能是通过使TGF-β1/Smads途径中的P-Smad2、Smad4表达减少，使Smad7表达增加，部分抑制人心房纤维化，防止房颤发生。

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Effects of Transforming Growth Factor-β1 and Atorvastatin on the Expression of Collagen Type I P-Smads in Human Atrial Fibroblasts

CHENG Xian-lu, HUANG Qi-lei, ZHANG Jian-cheng.
Department of Cardiology, Nanping First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Nanping (353000), Fujian, China

Objective: To observe the effects of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and atorvastatin on expressions of collagen type I P-Smad2, Smad4 and Smad7 in human atrial fibroblasts, and to explore the fibrosis and anti-fibrosis mechanisms in human atrium.

Cardiology; Atrial fibrillation; Myocardial fibroblast; Transforming growth factor-β1; Smads protein; Atorvastatin

2014-09-24）

（编辑：常文静）

353000 福建省南平市，福建医科大学附属南平第一医院心内科（程显禄、黄琦磊）；福建医科大学省立临床学院（张建成）

程显禄副主任医师硕士主要从事临床心内科工作 Email：wer_101@163.com

张建成 Email：fjzhangjiancheng@yahoo.com.cn

R54

1000-3614（2015）06-0562-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.06.013