刘国军，温世斌

（酒泉市人民医院，甘肃 酒泉 735000）

线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的实践探讨

刘国军，温世斌

（酒泉市人民医院，甘肃 酒泉 735000）

目的 观察不同线栓头端处理方法及不同插线深度对线栓法制作成年Wistar大鼠大脑中动脉阻断再灌注模型（MCAO/R）造模效果及大鼠存活率的影响。方法 依据改良Longa线栓法制作MCAO/R模型，插入不同深度尼龙线制作模型。于24小时、48小时后测定神经功能缺损评分并观察各组大鼠存活率。比较线栓头端蘸蜡处理法和熏香烧灼处理头端法制作MCAO/R模型48小时存活率及神经功能缺损评分。结果 第二组、第三组、第四组大鼠24小时和48小时的存活率和神经功能缺损评分与第一组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中大鼠存活率第一组最高，第四组最低；神经功能缺损评分第一组最低，第四组最高。两种线栓头端处理方法在相同插线深度（1.8 cm、2.0 cm、2.2 cm）的存活率和神经功能缺损评分方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 蘸蜡法与熏香烧灼法处理线栓头端对造模成功率无明显影响。线栓插入越深，神经功能缺损评分越高，存活率越低。线栓插入深度2.0 cm更适用于建立大鼠MCAO/R模型。

线栓法；大鼠；局灶性脑缺血再灌注模型

线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型（MCAO/R）被普遍认为是脑缺血的标准动物模型，特别适合于局部脑损伤后神经功能改变及治疗药物评价等实验研究［1-2］。不同线栓头端处理方法及不同插线深度对线栓法制作MCAO/R模型影响的相关研究较少，因此，本研究观察不同线栓头端处理方法及插线深度对线栓法制作MCAO/R模型造模效果及大鼠存活率的影响，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

SPF级成年Wistar大鼠56只，体质量（300±20）g，购自甘肃中医学院实验动物中心。直径0.26 mm尼龙线。

1.2 MCAO/R模型制作

1.2.1 分组 大鼠适应环境7天后随机分成7组，每组8只。第一、二、三组均设模型组及对照组，这6个组线栓插入深度分别为1.8 cm，1.8 cm；2.0 cm，2.0 cm；2.2 cm，2.2 cm。第四组线栓插入深度至最大，直至遇到较大阻力且大鼠出现深呼吸为止（约2.4～2.5 cm）。

1.2.2 模型制作 第一、二、三组中的模型组采用熏香烧灼头端，第一、二、三组中的对照组采用蘸蜡法处理线栓头端。（1）线栓及线栓头端的处理。将直径0.26 mm的尼龙线剪成5 cm长的小段，60℃～70℃加热2小时制作成外切角约为30°左右的弧形，头端用熏香快速烧灼，使一端熔化成球形，然后打磨并用75%的酒精浸泡处理备用。另选尼龙线小段，将头端蘸蜡后倒垂，待头端凝固成球形，保持头端直径均为0.30 mm且包被多聚赖氨酸。

（2）插入深度依据及线栓标记。依据崔龙等“同身寸”法估算大鼠局灶性脑缺血模型线栓深度。用血管钳夹标记等长度对比（血管钳内面作为测量标准）以及使用0.5 mm、1.0 mm、1.5 mm、3.0 mm粗细不同的记号笔标记预插线栓深度，并分组比较其印记标记及同组误差。

（3）模型制作过程。采用改良Longa线栓法［3］，以10%水合氯醛麻醉，术区常规剃毛消毒，颈部右侧旁正中切开，逐层分离，暴露右侧颈总动脉（CCA），并于CCA挂手术线备用。在颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）挂线。分离暴露ECA主干，在其根部打结。小动脉夹夹闭CCA近心端，夹闭ICA。在CCA近头端距分叉部5 mm处斜行剪一小口，导入线栓进入ICA。移开夹在ICA的小动脉夹，将线栓插入至设计深度，遇阻力停止。结扎切口处CCA挂线，去除CCA的血管夹。确认无出血后缝合皮肤，皮肤外留线头约0.5 cm，术后2小时抽出线栓形成再灌注。

1.3 观察指标与测定方法

1.3.1 神经功能缺损评分 建模成功表现：左前肢持续屈曲，提尾实验阳性。侧推抵抗力减弱，转圈实验阳性。采用Longa评分标准，1～4分为造模成功。0分：无神经系统功能缺损症状，活动正常；1分：轻微神经功能缺损，对侧前肢不能完全伸展；2分：中度局灶性神经功能缺损，爬行时向对侧转圈；3分：重度局灶性神经功能缺损，行走时身体向偏瘫侧倾倒；4分：不能自主行走，意识丧失；5分：死亡［4-6］。期间注意观察大鼠呼吸及心率变化。

1.3.2 存活率 术后24小时及48小时统计动物存活数，计算存活率。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠24小时、48小时存活率和神经功能缺损评分（见表1）

表1 各组大鼠24小时、48小时存活率和神经功能缺损评分（±s，分）

表1 各组大鼠24小时、48小时存活率和神经功能缺损评分（±s，分）

注：与第一组比较，＊P＜0.05

组别第一组第二组第三组第四组插线深度（cm）1.8 2.0 2.2 2.5存活率（%）24小时48小时100.0 87.5 62.5 37.5＊＊＊100.0 75.0 50.0 25.0＊ ＊＊神经功能缺损评分1.0±0.0 1.9±0.7＊2.8±0.8＊3.6±0.6＊

第二、三、四组大鼠24小时和48小时存活率与第一组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中第一组最高，第四组最低；不同组神经功能缺损评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中第一组最低，第四组最高。

2.2 不同线栓头端处理方法对模型的影响（见表2）

表2 不同线栓头端处理方法对模型的影响（±s，分）

表2 不同线栓头端处理方法对模型的影响（±s，分）

组别第一组第二组第三组插线深度1.8 cm 2.0 cm 2.2 cm P模型组对照组模型组对照组模型组对照组48小时存活率（%）100.0 100.0 75.0 75.0 50.0 50.0神经功能缺损评分1.0±0.0 1.0±0.2 2.0±0.5 2.2±0.6 2.8±0.8 2.7±0.6＞0.05＞0.05＞0.05

将熏香烧灼头端的设为模型组，将蘸蜡法处理头端的设为对照组。头端大小均匀一致且均需经过多聚赖氨酸处理。

2.3 不同粗细记号笔尖与血管钳夹标记印记的区别（见表3）

表3 不同粗细记号笔尖标记印记与血管钳夹标记印记的区别（±s，mm）

表3 不同粗细记号笔尖标记印记与血管钳夹标记印记的区别（±s，mm）

同组误差（mm）记号笔标记血管钳夹标记笔尖粗细（mm）0.5 1.0 1.5 3.0 -印记宽度0.5±0.10 1.0±0.15 1.5±0.20 3.0±0.30 -＜0.1 0.1±0.0 0.2±0.1 0.3±0.1 0.0

不同粗细笔尖标记印记组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；0.5～1.0 mm印记细，需要仔细辨认，3.0 mm印记易扩大，同组误差大而使插入深度无法精确。调查显示，血管钳夹标记与不同粗细记号笔尖标记误差比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

线栓法制作MCAO/R模型因易于操作且损伤小、可重复性高而应用广泛［7］。但是线栓直径、线栓头端直径及头端有无包被多聚赖氨酸、术中出血量、线栓留置时间、线栓插入深度及血管解剖等因素均可影响MCAO/R模型制作的成功率和可重复性［8-9］。

（1）线栓的制备至关重要，包括匹配体重大鼠线栓直径的选择、线栓头端的科学处理及其弧度和插入线栓深度的精确标记。线栓加热制作成外切角约为30°左右的弧形，可确保线栓弧度与大鼠颈内动脉走行一致，插入线栓时更容易调整角度和方向使其准确进入ICA。本研究表明，只要操作准确，线栓头端蘸蜡法与头端熏香烧灼法处理对造模效果影响不大。具体插线直径的选择应根据大鼠体质量进行相应调整。研究证明，体质量为（280±20）g的大鼠更适合造模。

（2）插线深度对造模结果的影响：本研究表明，随着线栓插入深度增加，大鼠神经功能缺损评分增高，说明脑梗死体积不断增大，但是大鼠存活率明显降低。当线栓插入深度最深（2.4～2.5 cm）时，死亡率过大而影响实验进行，死亡原因可能是脑梗死面积过大而症状过重，或导致蛛网膜下腔出血，或线栓穿破血管致脑实质内出血而加重脑卒中症状。当线栓插入深度为2.0 cm时，神经功能缺损评分适合且术后存活率较高，术后48小时大鼠存活率可达75.0%。因此，建议建立（280±20）g实验性Wistar大鼠MCAO/R模型的插入线栓深度为2.0 cm。

（3）插线深度的准确标记：目前报道MCAO/R模型制备的线栓多采用记号笔标记尼龙线刻度，笔者经过多次反复实践认为该方法存在缺陷，即记号笔细则容易模糊标记点，而记号笔粗则容易使标记印过大甚至超过0.3 cm，以致误差较大，插入深度无法精确。血管钳夹标记误差几乎为0，因此，应将线栓统一剪成5 cm小段并用小的血管钳夹在预插线深度，通过比较插线长度的方法来判断插入的深度，既可保证插入深度精确，又可节省线栓处理时间。

综上所述，正确处理线栓和选择插入线栓的合适深度是保证线栓法制备大鼠MCAO/R模型成功的关键。血管钳夹标记插线深度的误差小，节省了操作时间，并使插线的插入深度更加精准。

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1671-1246（2015）14-0075-02