王孟军

重组人胸腺肽α1研究进展

王孟军

胸腺肽 α1（thymosin α1）是一种具有免疫调节作用的小分子活性多肽，已广泛应用于临床，主要用于原发性和继发性免疫缺陷症，如慢性乙型肝炎、重症乙型肝炎、抗病毒、治疗 AIDS等，并用作各种恶性肿瘤前期化疗、放疗的辅助用药［1-3］。

胸腺肽 α1的生产技术经历了生物提取、固相合成等技术发展过程，目前主要采用固相合成法生产，虽然与生物提取法相比在质量、成本等方面有较大优势，但仍然没有解决工业化大规模生产等问题。通过查询各种公开资料及汇总分析各种方法、技术状况，发现采用基因工程重组技术生产重组人胸腺肽 α1成为当前研发的热点，且首个重组人胸腺肽α1药品即将获批上市，显示该技术具有较好的竞争优势和发展潜力，将成为今后胸腺肽 α1技术发展的主要方向。

1 胸腺肽 α1的制备技术

Goldstein等［4］在 20世纪 70年代末期从胸腺生成素第 5组分（TF5）中分离纯化出一种小分子生物活性多肽，具有胸腺肽类似的生物活性，命名为胸腺肽 α1。它由 28个氨基酸组成，等电点为 4.2，相对分子量 3108，结构式为：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。

目前生产胸腺肽 α1的技术有生物提取法和固相合成法，生物提取法是以新鲜小牛胸腺组织为原料，采用冻融和离子色谱法提纯获得胸腺肽 α1，固相合成法主要采用Wang树脂等为起点，逐个添加氨基酸延伸肽链长度合成胸腺肽 α1。

生物提取法以动物组织为原料，受原料来源及新鲜程度等影响，收率和质量不易控制。曹强庚等［5］认为不同年龄的牛胸腺组织中胸腺肽含量存在很大差别，刚出生的乳牛胸腺肽含量最高，而材料的新鲜程度也对胸腺肽的质量和收率有较大影响。尽管生物提取法通过改进工艺而不断提高收率，但是胸腺肽在胸腺组织中的含量很低（＜1%）［6］，其有效成分胸腺肽 α1在市售胸腺肽粗粉中的含量也仅为 0.6%～1%。因此，原料来源少和收率低是生物提取法制备胸腺肽α1的最大限制因素。

固相合成法可生产纯度很高的胸腺肽 α1，如刘标和汤斌［7］采用反相离子对液相色谱法，通过多步分离纯化获得纯度达 99.5%的胸腺肽 α1产品。但由于合成步骤多，周期长，条件苛刻，获得高纯度的产品需要多步纯化，造成总收率偏低，成本偏高，而大量使用的溶媒会污染环境，进一步增加了产品成本。因此，合成法生产技术关键是要减少反应步骤，采用更为温和的反应条件，如能将催化剂用于固相合成反应，尤其是各种生物酶，或将多个小肽链缩合反应生成多肽的“多肽片段链接法”［8］等技术应用于胸腺肽 α1的合成中，将会有很好的效果。

现有的生物提取法和固相合成法生产胸腺肽 α1因受到原料、技术、环境保护等因素影响，其生产成本居高不下，市场售价偏高，如 1.6 mg/支商品名为“日达仙”的注射用胸腺肽 α1药品售价高于 700元，因此有必要寻求新的解决途径。

2 重组人胸腺肽 α1制备技术

多肽类物质来源于生物有机体，利用基因重组技术将目的基因整合到宿主中，使其具备表达目标产物的能力，通过发酵方法可以获得大量的目标产物。经过研究者的不懈努力，重组人胸腺肽 α1的技术已经日渐成熟，首个产品即将上市［9］，将成为极有力的竞争者。

2.1 基因工程菌的构建技术

胸腺肽 α1是由 28个氨基酸组成的小分子多肽，选择合适的目的基因载体和宿主是获得有效表达胸腺肽 α1基因工程菌的关键。归纳已有文献资料报道，目前基因工程菌的构建主要有以下三种方式。

2.1.1 多串体基因 Xue等［10］利用随机退火与 PCR技术相结合的方法构建了胸腺素 α1的多串体基因，并成功克隆到大肠杆菌中；东北制药集团股份有限公司采用双酶切方法将胸腺肽 α1四串体基因克隆至 pGEX-4T-2质粒相应位点，构建融合表达载体 pGEX-4T-2-4Tα1，将其转化至大肠杆菌得到基因工程菌，在 IPTG诱导下以包涵体形式表达［11］。

2.1.2 融合蛋白 Zhang等［12］构建了 hTα1-histag融合蛋白，在大肠埃希菌 BL21中获得表达；陈培富等［13］将人工合成的人胸腺肽 α1基因插入到载体 pBV222，转化至大肠杆菌 DH5α菌株中，置 42℃ 诱导表达含胸腺肽 α1的可溶性融合蛋白；刘中禄等［14］将人工合成的胸腺肽 α1基因序列进行 PCR扩增和酶切后，用T4DNA快速连接酶连接构建 pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒，将重组体转化至大肠埃希菌 TB1菌中，成功构建了 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌；深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司将人工合成的融合蛋白基因重组到载体质粒 pet-22b中，将该表达载体转化到宿主大肠杆菌成功构建了工程菌［15］；Lao等［16］为了增强胸腺肽 α1在抗肿瘤治疗中的药效，将合成 Tα1-iRGD基因序列插入到载体pET32a，转化至大肠杆菌 BL21（DE3），使胸腺肽 α1与肿瘤穿透肽 iRGD融合表达。

此两种方法是将胸腺肽 α1肽链人为扩充，使其易于克隆到宿主细胞中并能有效表达目标产物，但产物是以融合蛋白形式存在，需要进行酶切等后续处理才能获得单一的胸腺肽 α1。

2.1.3 单体基因 长春金赛药业有限责任公司构建了分泌型表达载体 oSTII/Tα1，并转入大肠杆菌（E.coli W3110）使之成为工程菌，然后进行高密度发酵培养，目标产物以单一组分分泌在细胞间质中［17］；熊燕燕和汤斌［18］将人工合成的胸腺肽 α1单体基因连接到 pPIC9K质粒上，构建表达载体 pPIC9K-Tα1，整合到毕赤酵母中，目标产物直接分泌到发酵液中，相比于融合表达，大大简化了后续产品分离步骤。

比较以上不同方法可看出，采用多串体基因或融合蛋白方式克服了小分子肽难以表达的难题，构建了有效表达胸腺肽 α1的工程菌，但因表达的目标产物与其他蛋白质结合，需要进行细胞破壁释放，在后续纯化时需要进行酶切等处理，增加了技术难度和成本。然而，采用与肿瘤穿透肽等蛋白结合进行融合表达，使其具备新的功能，是一个很好的创新思路。相比而言，单体基因技术具有相对优势，将合成的胸腺肽 α1单体基因与相关质粒结合，整合到宿主细胞中，其优势在于可将产生的胸腺肽 α1分泌到发酵液中，大大降低了后续处理难度。

2.2 发酵纯化技术

在成功获得能表达胸腺肽 α1工程菌的同时，其发酵纯化技术也取得了进展。因基因工程菌的不同特点，发酵条件的优化和后续纯化又各有特点，目前主要有两种方式。

采用融合蛋白方式构建的工程菌在发酵时往往需要特定条件进行诱导，主要以胞内产物形式存在，纯化时需要破壁及酶切融合蛋白。如深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司将获得的基因工程菌［E.coli，载体质粒pet-22b/BL21（DE3）］在 10 L发酵罐中进行高密度发酵培养，经分离后每升发酵液获得 127.3 g湿菌体，纯化过程采用菌体破碎、亲和层析、肠激酶水解融合蛋白、离子交换等方法获得纯度大于 98%的重组胸腺肽 α1，折合表达量约254.6 mg/L［15］；刘中禄等［19］将获得的重组工程菌（E.coli，Tα1/PMAL-C2x/TB1）进行发酵并诱导表达目的蛋白MPB-Tα1，经亲和层析纯化，凝血酶裂解融合蛋白，Source Q离子交换，得到蛋白纯度大于 95% 的胸腺肽 α1。

与上述技术相比，采用单体基因方式获得的基因工程菌可获得胞内或胞外产物，其在后续处理上有较大的优势。如熊燕燕和汤斌［18］采用获得的含 pPIC9K-Tα1的毕赤酵母进行培养，将目的蛋白直接分泌到发酵液中，取发酵液上清，过 DEAE52、SephadexG-25柱纯化后获得目的蛋白，采用Tricine-SDS-PAGE和 HPLC法分析，表达量为 4.8 mg/L。

无论以何种方式获得的重组工程菌，其蛋白表达水平和后续的纯化技术将决定其是否具备规模化生产能力，上述方法中构建的单体基因重组的毕赤酵母工程菌具有一定的优势，应成为今后技术发展的方向。由于其将目的蛋白直接分泌到发酵液中，经过 DEAE52和 SephadexG-25两步纯化后可直接得到纯度较高的胸腺肽 α1，相比于融合表达，大大简化了分离步骤，降低了成本，易规模化生产。

2.3 基因重组技术成为研发热点

随着生物技术的发展，采用基因工程重组技术获得胸腺肽 α1逐渐成为研发热点，中国专利数据库（http://epub. sipo.gov.cn/）数据显示，与胸腺肽 α1重组技术相关的专利有 17项申请（表 1），国内已有企业正在进行药品生产文号报批，重组人胸腺肽 α1技术有望实现产业化。

表1 基因工程重组胸腺肽 α1的相关专利

2.4 即将产业化的专利技术

长春金赛药业有限责任公司采用单体基因法构建了工程菌（E.coli，oSTII/Tα1/W3110），并在 150 L发酵罐中进行了高密度培养，目标产物以单一组分分泌在细胞间质中。发酵终止后收集菌体，采用低温、低渗法裂解菌体，使用阴、阳离子交换层析进行粗纯，SephacrylS-100HR凝胶过滤层析法进行精纯，获得了纯度大于 98%的重组人胸腺肽 α1，折合每升发酵液可得到大于 110 mg的纯品［17］。

该技术以酵母粉、葡萄糖等为原料，采用传统发酵补料工艺生物合成胸腺肽 α1，其单一组分的纯化过程较为简单，步骤较少，较易获得高纯度产品。由于其具有较高的表达量、低廉的原材料成本，简便的操控工艺，易于放大等特点，使工业化规模生产成为可能。

3 重组人胸腺肽 α1注册现状

1997年美国赛生（Sciclone）公司开发的胸腺肽 α1获准上市，并在 24个国家批准用于慢性乙型肝炎的治疗，在欧、美、日等国家和地区也用于治疗丙型肝炎、肝细胞癌及免疫疾病。

据医药经济报报道，2012年全国 22城市样本医院购入金额领先的 30个品种中，胸腺肽 α1位列第 18位，占比 0.73%［20］；2013上半年全国 22城市样本医院购入金额领先的 30个品种中胸腺肽 α1位列第 21位，占0.69%［21］，可见胸腺肽 α1是一种应用较为广泛的药物。

查询国家食品药品监督管理总局（CFDA）网站（http:// www.sfda.gov.cn/），数据显示国内胸腺肽 α1原料药生产批件有 4个，制剂生产批件有 10个，其中进口制剂批件1个；重组人胸腺肽 α1新药注册申报有两家，一家处于生产报批阶段，另一家处于临床研究阶段。

基因工程重组技术解决了获得高效表达胸腺肽 α1工程菌的难题，随着生物技术上下游工艺水平的不断提高，重组人胸腺肽 α1技术有望实现产业化。2013年长春高新［9］已完成注射用重组人胸腺素 α1的临床研究，获批上市后将成为首个采用基因工程重组技术生产的胸腺肽 α1产品。深圳海王药业有限公司研制的注射用重组人胸腺肽 α1于2009年 7月获得临床批件，目前正处于 II期临床试验中。

4 展望

胸腺肽 α1是一种临床应用较广的免疫调节剂，其在调节人体自身免疫能力，促使患者免疫平衡方面有很好的作用，广泛用于自身免疫性疾病及肿瘤的防治。据国家卫生和计划生育委员会 2013年公布的数据表明中国有近 1亿乙肝病毒携带者［22］，《2012中国肿瘤登记年报》数据显示 2009年全国新发肿瘤病例为 312万例，肿瘤死亡率为 180.5/10万，肿瘤防治形势不容乐观［23］。由于肝炎患者、癌症患者的数量庞大且发病率不断升高，预测免疫调节剂类药物市场需求仍将平稳增长。目前，固相合成仍是生产胸腺肽 α1的主要生产技术，基因工程重组技术正在成为新的研发热点。在众多开发的基因重组技术中，采用单体基因构建工程菌是一种有竞争力的技术，有望成为重组人胸腺肽 α1的主要技术发展方向。随着首个重组人胸腺肽 α1药品的上市，将会起到导向作用，从而促进技术水平不断提高，为工业化规模生产提供有力条件。

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2014-07-25