曹晓培，肖凤君，高瞻，杨月峰，张群伟，王立生，王恒湘，王华

重组腺病毒Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系感染效率的比较研究

曹晓培，肖凤君，高瞻，杨月峰，张群伟，王立生，王恒湘，王华

目的 以 Ad5-GFP及 Ad5/F35-GFP为对照，评价Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系的感染效率。

方法 制备并纯化Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP及Ad5/F35-GFP三种重组腺病毒，以不同的感染复数（MOI）感染乳腺癌细胞系 SKBR-3、MCF-7及肾癌细胞系 786O。48 h后，荧光显微镜观察 GFP的表达，流式细胞仪检测感染效率及不同细胞表面柯萨奇腺病毒受体（CAR）、CD46和桥粒芯糖蛋白质 2的表达。

结果 Ad5/F35-GFP对 SKBR-3、MCF-7及 786O均具有很高的感染效率，且其在较低的 MOI时就具有较高的感染效率；Ad5/F11p-GFP对 CD46高表达的 MCF-7及 786O具有较高的感染效率，5 MOI感染即可达到 60%以上的感染效率；而Ad5-GFP仅对 CAR高表达的细胞系 786O具有较高的感染效率，且感染效率随着 MOI的增加而升高。Ad5/F11p-GFP和 Ad5/F35-GFP对三种肿瘤细胞系的感染效率明显高于Ad5-GFP。

结论 对 5型腺病毒进行纤维顶球的改造，可增强对肿瘤细胞的感染效率。

5型腺病毒； 纤维顶球； 感染效率； 柯萨奇病毒-腺病毒受体； 抗原，CD46； 桥粒芯糖蛋白质2

腺病毒具有宿主范围广、安全、基因转移效率高、制备方便等优点，广泛应用于肿瘤的基因治疗［1-2］。目前基因治疗多以 5型腺病毒为载体，其感染效率与细胞表面的柯萨奇腺病毒受体（CAR）密切相关［3］，但在一些肿瘤细胞，特别是晚期和转移的肿瘤细胞表面，CAR受体的表达往往下调，因此，限制了其在基因治疗中的广泛应用。腺病毒主要是通过纤维顶球和细胞表面的受体相结合而进入细胞，因此，为克服上述缺陷，研究者们试图通过改造 5型腺病毒载体的纤维顶球，籍以提高对肿瘤细胞的感染效率［4］。Ad11和 Ad35型腺病毒属于 B组腺病毒，主要通过识别 CD46分子感染细胞［5-7］。因此，本研究利用本课题组鲁茁壮博士改构的 Ad5与 Ad11的嵌合载体 Ad5/F11p-GFP以及对照病毒 Ad5-GFP、Ad5与 Ad35的嵌合载体 Ad5/F35-GFP感染不同的肿瘤细胞，检测其基因转移效率，以期为基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、病毒 人胚肾 HEK293细胞，乳腺癌细胞系 SKBR-3、MCF-7（本实验室保存）培养于含 10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基中；肾癌细胞系 786O（本实验室保存）培养于含 10%FBS的RPMI 1640培养基中。

Ad5-GFP及 Ad5/F11p-GFP病毒种子为本实验室构建并保存；Ad5/F35-GFP病毒种子由北京师范大学樊晓龙教授惠赠。

1.1.2主要试剂及仪器 RPMI 1640和DMEM培养基为美国 Sigma公司产品；FBS为美国 Hyclone公司产品；桥粒芯糖蛋白质 2（Desmoglein 2）抗体为美国 GeneTex公司产品；CD46抗体为美国Biolegend公司产品；CAR抗体为美国 Thermo公司产品；FITC-羊抗鼠 IgG为美国 BD公司产品；CsCl为美国 Amresco公司产品；CCK-8为日本Dojindo公司产品。

CO2培养箱 3111、4℃ 离心机和酶联仪均购自美国 Thermo公司；超净工作台购自北京亚泰科隆实验技术开发中心；超速离心机、超速离心套管及离心管均购自美国 Beckman公司；透析袋购自美国 Pierce公司；高速台式离心机购自美国Heraeus公司；倒置荧光显微镜和普通显微镜购自日本 Olympus公司；FACS caliber流式细胞仪购自美国 Becton-Dickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒的扩增、纯化及感染滴度测定 利用 HEK293细胞，采用平皿法扩增获得病毒初提液，通过氯化铯密度梯度离心的方法进行病毒纯化；采用紫外分光光度计测定病毒颗粒滴度和纯度，利用有限稀释法测定病毒的感染滴度（IU/ml），按以下公式计算感染滴度：

1.2.2 FCM 分析三种重组腺病毒对不同肿瘤细胞的感染效率 分别将 SKBR-3、MCF-7、786O细胞按每孔 1×105接种在 24孔培养板中，置37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，第 2天换含5%FBS的培养基，用 Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP和Ad5/F35-GFP以不同的感染复数（0、5、10、20、50 IU/细胞）感染细胞，48 h后荧光显微镜下观察细胞中 GFP的表达，之后收集细胞，流式细胞仪检测 GFP的表达效率。

1.2.3 FCM 分析细胞表面受体表达情况 分别收集 SKBR-3、MCF-7和 786O细胞，每管 5× 105个，用 2 ml封闭液洗细胞，以 1500 r/min离心 5 min；细胞分别标记抗 CAR、CD46和Desmoglein 2一抗，室温孵育 1 h；用 2 ml封闭液洗细胞，1500 r/min离心 5 min，进行 2次，加入 FITC标记二抗 1 μl，室温避光孵育 0.5 h；用2 ml封闭液洗细胞 2次，400 μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。

1.2.4 CCK-8法分析三种重组腺病毒对肿瘤细胞的体外杀伤作用 分别将 SKBR-3、MCF-7、786O细胞按每孔 1×104/100 μl接种在 96孔培养板中，置 37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，第 2天换含 5%FBS的培养基，用 Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP和 Ad5/F35-GFP以不同的感染复数（0、100、101、102、103、104、105vp/细胞）感染细胞，培养 120 h后加 CCK-8，每孔 10 μl，后将 96孔板置于 37℃、5%CO2恒温培养箱中培养 3 h，酶标仪检测 450 nm吸光值。以未感染病毒的细胞活率作为 100%。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 三种重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定

腺病毒感染细胞后，光镜下，细胞变圆，脱落，出现串珠样改变；荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白GFP的表达，说明病毒成功感染 HEK293细胞（图 1）。对其进行扩增，采用 CsCl密度梯度离心法纯化病毒，对纯化后的病毒进行感染滴度及纯度的鉴定，结果表明，成功获得合格的重组腺病毒（表1）。

图1 重组腺病毒的制备［A：重组腺病毒感染 HEK293细胞，出现完全 CPE（×100）；B：荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达（×100）］Figure 1 Preparation of adenoviruses［A:Cytopathic effect after HEK293 cells infected with adenovirus（×100）；B:The expression of green fluorescent protein detected by fluorescence microscope（×100）］

表1 重组腺病毒的感染滴度及纯度测定结果Table 1 The purity and titers of adenoviruses

2.2 三种重组腺病毒对于不同肿瘤细胞系的感染效率

图2 20 MOI重组腺病毒感染三种肿瘤细胞系，流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达Figure 2 The expression of GFP in SKBR-3，MCF-7 and 786O cell lines infected in 20 MOI adenovirus detected by flow cytometry

图3 Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP和 Ad5/F35-GFP对三种肿瘤细胞系的感染效率（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）Figure 3 Infectious effect of Ad5-GFP，Ad5/F11p-GFP and Ad5/F35-GFP to three tumor cell lines（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

为明确 Ad5/F11p-GFP和Ad5/F35-GFP对不同肿瘤细胞的感染效率，将 Ad5/F11p-GFP、Ad5/F35-GFP和对照病毒 Ad5-GFP分别以 0、5、10、20及 50 MOI的感染强度感染 SKBR-3、MCF-7和 786O细胞，结果（图 2和图 3）显示，Ad5-GFP及 Ad5/F11p-GFP对 SKBR-3细胞感染效率较低，提高 MOI感染效率增加不明显，而Ad5/F35-GFP感染效率显著提高；Ad5-GFP对MCF-7细胞感染效率较低，MOI提高到 50，其感染效率亦低于 50%，而 Ad5/F11p-GFP和Ad5/F35-GFP对 MCF-7细胞的感染效率明显高于 Ad5-GFP，差异具有统计学意义；对于 786O细胞，Ad5/F11p-GFP和 Ad5/F35-GFP的感染效率较高，5 MOI感染效率即高于 70%，Ad5-GFP的感染效率随 MOI的提高明显升高，感染强度为 50 MOI时，感染效率可达 70%以上；Ad5/F35-GFP对三种细胞的感染效率明显高于 Ad5/F11p-GFP 和Ad5-GFP。

图4 流式细胞术检测 SKBR-3、MCF-7和 786O细胞表面受体表达情况Figure 4 The expression of CD46，CAR and Desmoglein 2 on SKBR-3，MCF-7 and 786O cell lines detected by flow cytometry

2.3 三种肿瘤细胞系表面受体检测

为明确介导三种重组腺病毒进入肿瘤细胞的受体表达情况，我们通过流式细胞术检测了三种肿瘤细胞系表面介导 5型腺病毒进入细胞的 CAR受体、介导 11、35型腺病毒进入细胞的 CD46分子以及当 CD46受体阻断后，11型腺病毒识别的Desmoglein 2受体。结果（图 4，表 2）显示，CAR受体在 SKBR-3细胞表达百分率最低，仅为（4.2± 0.2）%，在 MCF-7细胞表达率高于 SKBR-3细胞，在 786O细胞表达率可达（13.8±0.5）%；CD46受体在 MCF-7及 786O细胞表达百分率明显高于 SKBR-3；Desmoglein 2表达百分比在 SKBR-3细胞要高于 MCF-7及 786O细胞。

表2 三种受体分子在 SKBR-3，MCF-7 和 786O细胞的表达百分比Table 2 The expression percentage of three receptors on SKBR-3，MCF-7 and 786O cell lines

2.4 三种重组腺病毒对于肿瘤细胞的体外杀伤作用

为评价三种重组腺病毒在体外对于肿瘤细胞的杀伤作用，我们通过 CCK-8的方法检测了不同 MOI（vp/细胞）的三种重组腺病毒感染肿瘤细胞 5 d后肿瘤细胞的活率。结果（图 5）表明，Ad5/F35-GFP在体外对于肿瘤细胞的杀伤活性略高于 Ad5/F11p-GFP，而Ad5/F11p-GFP的杀伤活性高于 Ad5-GFP。Ad5/F35-GFP在 104vp/细胞的感染复数下，5 d几乎可以杀死全部肿瘤细胞；而Ad5/F11p-GFP在相同 MOI时活细胞比率维持在6%～8%，Ad5-GFP组活细胞比率大于 10%。

图5 Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP和Ad5/F35-GFP对三种肿瘤细胞系的体外杀伤作用Figure 5 Cytotoxic activities ofAd5-GFP，Ad5/F11p-GFP andAd5/F35-GFP in three tumor cell lines

3 讨论

目前发现的 50多种血清型的重组腺病毒中，以 5型腺病毒在基因治疗中应用最为广泛［1，8］。5型腺病毒可通过特异性识别细胞表面 CAR受体而进入细胞，进而发挥抗肿瘤作用，但有些肿瘤细胞，特别是晚期和转移的肿瘤细胞表面，CAR受体的表达往往下调，这就影响了其感染效率，降低了肿瘤治疗的疗效。本研究中，我们发现 SKBR-3细胞表面 CAR受体表达较低，因此，Ad5-GFP对其感染效率较低，即使提高感染强度，其感染效率提高也不明显。

CD46是一种普遍存在于细胞表面的受体膜蛋白，尤其是在肿瘤细胞中表达较高。B组腺病毒（Ad3、Ad11、Ad35等）可通过识别 CD46分子进入细胞［9-12］，因此，对 Ad5亲嗜性的修饰对于基因治疗的发展无疑起着重要作用。研究证实将Ad35型腺病毒的纤维基因相应部分取代 Ad5载体对应部分所构建的 Ad5/F35-GFP可以提高病毒的感染效率及靶向性［13-14］。我们课题组基于AdEasy腺病毒制备系统对 5型腺病毒纤维基因进行修饰，将 AdEasy-1载体中 5型腺病毒的纤维顶球和柄部替换为 11p型腺病毒的相应部分，成功构建重组 Ad5/F11p-GFP，该病毒可以高效感染造血细胞。为了验证改构的重组腺病毒对于其他肿瘤细胞的感染效率，我们选用 Ad5/F35-GFP作为阳性对照。实验证实此改构可明显提高其对CD46分子表达率高的肿瘤细胞 MCF-7和 786O的感染效率，但仍略低于 Ad5/F35-GFP。重组病毒对肿瘤细胞的杀伤活性结果表明，Ad5/F35-GFP对于肿瘤细胞的体外杀伤活性略优于 Ad5/F11p-GFP 和 Ad5-GFP。但有研究报道，虽然 Ad35在体外对肿瘤细胞的感染效率及杀伤活性高于 Ad11，但其在体内几乎没有抗肿瘤活性［15］。因此，我们认为，Ad5/F11p具有较 Ad5/F35更好的应用前景。

研究表明，人 B组腺病毒按照其识别的受体可以分为三类，第一类：Ad16、Ad21、Ad35和Ad50，识别 CD46分子；第二类：Ad3、Ad7和Ad14，识别受体 X；第三类：Ad11，优先识别受体 CD46，但是阻断 CD46分子时，可识别受体 X。Desmoglein 2是受体 X的一种［7］。但本研究结果提示，SKBR-3细胞表面 CD46分子表达水平低，Ad5/F11p-GFP对其感染效率也低。虽然其表面 Desmoglein 2分子表达水平较高，但几乎不会影响其感染效率。而对 CD46高表达但Desmoglein 2相对低表达的 MCF-7和 786O细胞，Ad5/F11p-GFP的感染效率较高。结果表明，在本研究所选用的三种肿瘤细胞中，Desmoglein 2 对 Ad11的感染效率并没有太大影响。另外，对于SKBR-3细胞来说，虽然其表面 CD46分子表达水平低，但 Ad5/F35-GFP对其感染效率却很高。其原因可能是重组病毒 Ad5/F35在较低感染复数时已经达到饱和，当 5 MOI病毒感染细胞时，其平均荧光强度已经达到 546。也就是说，此时Ad5/F35进入肿瘤细胞不再依靠表面受体，感染效率与感染复数的增加不成比例。这也提示我们在今后的研究中，可以进一步降低 Ad5/F35的感染复数。

综上，本研究证实改构重组腺病毒 Ad5/F11p-GFP和 Ad5/F35-GFP对肿瘤细胞的感染效率明显高于 Ad5-GFP，Ad5/F11p-GFP主要通过识别CD46分子进入细胞，该研究为肿瘤的基因治疗提供了实验数据。

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Methods Three kinds of recombinant adenovirus Ad5-GFP，Ad5/F11p-GFP and Ad5/F35-GFP were prepared and purified to infect SKBR-3，MCF-7 and 786O cell lines with different multiplicity of infection（MOI）.After 48 hours，the expression of green fluorescent protein was detected by fluorescence microscope.The expressions of coxsackie virus and adenovirus receptor（CAR），CD46 and Desmoglein 2 on SKBR-3，MCF-7 and 786O cell lines were detected by flow cytometry.

Results The infectious effects of Ad5/F35-GFP in SKBR-3，MCF-7 and 786O cells were higher at lower MOI.The infectiouseffects of Ad5/F11p-GFP in MCF-7 and 786O，which had high expression of CD46，were higher.It could infect more than 60%of cells at 5 MOI.But Ad5-GFP only had high infection efficiency in 786O cell lines which had higher expression of CAR，and the infection efficiency was improved with increasing of MOI.Ad5/F11p-GFP and Ad5/F35-GFP had higher infection efficiency in SKBR-3，MCF-7 and 786O cells thanAd5-GFP did.

Conclusion Fiber-modification to Ad5 vector which is derived from chimeric adenovector containing Ad11p fiber might posses high infection efficiency in tumor cell lines.

Infectious effect of recombinant adenovirusAd5/F11p-GFPon different tumor cell lines

CAO Xiao-pei，XIAO Feng-jun，GAO Zhan，YANG Yue-feng，ZHANG Qun-wei，WANG Li-sheng，WANG Heng-xiang，WANG Hua

Objective To evaluate the infection efficiency of recombinant adenovirus Ad5/F11p-GFP in different tumor cell lines by using Ad5-GFP andAd5/F35-GFP as control adenovirus.

Serotype 5 adenovirus； Fiber shaft and knob； Infection efficiency； Coxsackievirus and adenovirus receptor；Antigens，CD46；Desmoglein 2

s:WANG Hua，Email:wanghua@bmi.ac.cn；WANG Heng-xiang，Email:wanghengxiang123@aliyun.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.002

国家自然科学基金（81372924），国家高技术研究发展计划（863计划）青年科学家课题（2014AA020515）

100850北京，军事医学科学院放射与辐射医学研究所实验血液学研究室（曹晓培、肖凤君、高瞻、杨月峰、张群伟、王立生、王华）；100142北京，空军总医院血液科（曹晓培、王恒湘）

王华，Email：wanghua@bmi.ac.cn；王恒湘，Email：wanghengxiang123@aliyun.com

2014-12-22

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术，2015，10（2）:102-108

Author Affiliations:Department of Experimental Hematology，Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850，China （CAO Xiao-pei，XIAO Feng-jun，GAO Zhan，YANG Yue-feng，ZHANG Qun-wei，WANG Li-sheng，WANG Hua）；Department of Hematology，Air Force General Hospital，Beijing 100142，China（CAO Xiao-pei，WANG Heng-xiang）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:102-108