陈玉保，胡佑帆，熊芳琪，刘欣，彭国平

3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素对碱性脂肪酶活性影响机制的研究

陈玉保，胡佑帆，熊芳琪，刘欣，彭国平

目的 探讨黄酮类化合物 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素对碱性脂肪酶活性的影响。

方法 采用 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素作为抑制剂，以改进后的铜皂法测定脂肪酶活性，测定 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素的浓度与脂肪酶活性的关系，得出该化合物对脂肪酶活性影响，并测定其 IC50值。

结果 该化合物对碱性脂肪酶活性的抑制作用为非竞争性抑制，其 IC50为 3.17×10-7mol/L。米氏常数 Km=100 mmol/L，抑制常数 Ki=2.7×10-7mol/L。

结论 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素对碱性脂肪酶的抑制机制是其与酶的活性部位以外的基团作用而导致酶活性降低，呈非竞争性抑制。

3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素； 酶抑制剂； IC50

脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性脂类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，并具有其他催化活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶活性对于维持人体健康具有重要意义，酶活性过高、过低均不利于人体健康，在消化系统中，脂肪酶活性过高，促进了脂类物质的分解与吸收，提高了血液中胆固醇等脂类物质分解成分的含量，容易导致肥胖、高血脂症。

以本课题组合成的 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素作为试验材料，结构如图 1，研究该化合物对碱性脂肪酶的抑制作用，探讨黄酮类化合物对脂肪酶的抑制机制，为进一步寻找新的脂肪酶抑制剂，开发出活性高、脂肪酶抑制作用特异性强的新的减肥药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器 Vis-7220可见分光光度计为北京瑞利分析仪器公司产品；YXJ-2高速电动离心机和ZD-85气浴恒温振荡器为常州华普达教学仪器有限公司产品。

图1 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素结构Figure 1 Structure of 3'，4'，5，7-four（2-ethyl-phosphoryl）-luteolin

1.1.2 试剂 油酸、甲苯、橄榄油、醋酸铜、脂肪酶、甲醇、乙醇、磷酸二氢钾、氢氧化钠均为分析纯；3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素由本课题组合成，通过分离纯化，纯度为 95%。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酶溶液的制备 精确称取 0.5 g酶粉，用磷酸缓冲液（pH 7.0）定容到 100 ml，配制成浓度为 5 mg/ml的酶液，置于 4℃ 以下的冰箱中冷藏备用。

1.2.2 显色剂制备 准确称取 5 g醋酸铜，加入95 ml蒸馏水溶解，配制 5% 醋酸铜溶液，用吡啶调节 pH至 6.1，即得脂肪酸显色剂。

1.2.3 油酸吸光度标准曲线的制定 配制一系列不同浓度的油酸/甲苯溶液，分别取 4 ml于锥形瓶中，加 1 ml显色剂，磁力搅拌 3 min，油酸分子与 Cu2+生成绿色的络合物，离心后取上层有机相在 710 nm下测定吸光度，用未加油酸的空白溶液作为参比。以吸光度对油酸浓度作图，作油酸吸光度标准曲线。

1.2.4 脂肪酶活性测定方法 调节恒温摇床至37℃，取 50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）3 ml、橄榄油 1 ml于 50 ml锥形瓶中，置摇床内预热10 min，然后注入 0.1 ml酶溶液，置入恒温摇床中搅拌 10 min，立即加 5 ml甲苯，继续搅拌 2 min，终止反应，同时萃取生成的脂肪酸。将溶液转移至离心试管中，在 4000 r/min下离心 10 min，有机相和水相分层澄清。取上层有机相 4 ml于 10 ml离心管中，加 1 ml显色剂涡旋振荡 3 min，产生的脂肪酸与 Cu2+生成绿色络合物，4000 r/min下离心 10 min。取上层含有脂肪酸铜的甲苯溶液，用分光光度计在 710 nm波长下测其吸光度。以同法制备不含脂肪酶的空白溶液为参比，对照脂肪酸吸光度的工作曲线，即可求得脂肪酸的浓度。

1.2.5 脂肪酶酶活力定义及计算 在一定条件下，每分钟释放 1 μmol脂肪酸消耗的酶量定义为1个脂肪酶活力单位（U）。以如下公式计算酶活：

式中：X为脂肪酶活力，单位为 U/g；C为脂肪酸浓度，单位为 μmol/ml；V为脂肪酸浓度的体积，单位为 ml；m为酶液的用量，单位为 mg；t为作用时间，单位为 min。

1.2.6 脂肪酶酶促反应速率定义及计算 反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。实验中的酶促反应速率选择单位时间内生成物浓度的增加来表示，即选择油酸浓度的变化作为脂肪酶酶促反应速率大小的衡量标准。计算反应速率：v=C/t。式中：C为在一定时间内反应体系中生成的油酸浓度，单位为 μmol/L；t为酶促反应作用时间，单位min。

1.2.7 脂肪酶抑制率的测定 加入脂肪酶抑制前后酶活的差值与原酶活之比值定义为酶抑制率，按脂肪酶酶活测定方法，在预热前加入定量脂肪酶抑制剂，测定其剩余酶活，即可计算出抑酶活性，抑制剂对脂肪酶的抑制率为：

以抑制剂浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，做回归曲线，于抑制率 50%处得到浓度 IC50。

1.2.8 脂肪酶抑制剂 IC50的测定［1-2］按 1.2.5的实验方法，固定反应体系中底物浓度为 50 mmol/L，加入 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素使得反应体系中抑制剂浓度分别为 0.5×10-7、1.0×10-7、2.0×10-7、4.0×10-7、6.0×10-7、8.0×10-7、10.0× 10-7mol/L，设置不加 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素的反应体系作为对照，分别测得加入抑制剂前后的酶活。

1.2.9 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素对脂肪酶酶促反应动力学的影响［3-5］

⑴底物浓度对酶活的影响 固定反应体系中3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素浓度为 1.0× 10-7mol/L，改变底物浓度，加入橄榄油使得反应体系中底物浓度分别 20、40、60、80、100、120、140、160、180 mmol/L。设置另一组反应体系，不加抑制剂，反应体系中底物浓度同上。

⑵抑制剂浓度对酶活的影响 固定反应体系中底物浓度，设置两组反应体系，其中一组底物浓度为50 mmol/L，另一组底物浓度为 100 mmol/L。两组反应体系中，都加入 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素使得体系中的抑制剂浓度分别为0.5×10-7、1.0×10-7、2.0×10-7、4.0×10-7、6.0×10-7、8.0×10-7、10.0×10-7mol/L。

2 结果

2.1 油酸吸光度标准曲线的制作及脂肪酶活性的测定

将吸光度值对油酸浓度作图，经过拟合，得到如下方程：A=0.2852 C+0.0106，r2=0.9919。

按照 1.2.4方法分别制备 3份待测液和 1份不加酶液的对照液。在 710 nm下分别测定其吸光度并计算脂肪酶活大小，得到其酶活为 3083 U/g。

2.2 IC50的计算

结果如图 2所示：不同浓度的脂肪酶抑制剂对脂肪酶活性均有一定的抑制作用，其抑制活性呈剂量正相关。用 Excel软件分析图中曲线得抑制剂的 IC50为 3.17×10-7mol/L。

图2 不同浓度的抑制剂对脂肪酶活性的抑制作用Figure 2 Inhibition of alkaline lipase activity by different concentrations of inhibitor

2.3 脂肪酶抑制剂对酶促反应动力学的影响

固定抑制剂浓度及定量的脂肪酶，测定不同底物浓度时酶反应的残余酶活，求出相应的反应速率，反应速率的计算方法为：A=0.2852 C+0.0106；v=C/t；

结果如图3：

图3 底物浓度对反应速度的影响Figure 3 Effect of substrate concentration on the reaction rate

用 Excel软件作图并对脂肪酶酶促反应的米氏方程（Michaelis-Menten）进行分析，其中反应酶学性质的米氏方程定义为：

式中，v为反应速度，单位为 μmol/（L·min）；［S］为底物浓度，单位为 mmol/L；vmax为最大酶促反应速率，单位为 μmol/（L·min）；Km为米氏常数，是当酶促反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位为 mmol/L。

用 Excel软件对数据进行处理，分析可分别得到未加入和加入抑制剂的脂肪酶动力学方程：

在未加抑制剂的情况下得到方程：

在加入抑制剂的情况下得到方程式：

用底物浓度的倒数和反应速度的倒数做图，得到相应的 Lineweaver-Burk双倒数图，如图 4所示。

图4 反应速度与底物浓度的 Lineweaver-Burk双倒数图Figure 4 The Lineweaver-Burk doureciprocal of substrate concentration and reaction rate

用 Excel软件拟合 Lineweaver-Burk双倒数图，得到加入抑制剂前后的直线方程：

在未加抑制剂的情况下得到方程式：

从上述线性关系可以看出，双倒数作图直线交于横轴，其交点为（–0.01，0），这是非竞争性抑制作用的特点。根据非竞争性抑制作用双倒数作图交点坐标为（–1/Km，0），即可得 –1/Km=–0.01 mmol/L，则 Km=100 mmol/L。

从加入抑制剂前后脂肪酶酶促反应动力学米氏方程可以看出 vmax和 Km变化。加入3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素后 vmax变小，而 Km值不变，进一步证明了 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素的抑制作用类型为非竞争性抑制。未加入抑制剂时脂肪酶的 vmax和 Km分别为1415 μmol/（L·min）和 100 mmol/L；加入抑制剂时脂肪酶的 vmax和 Km分别为 797 μmol/（L·min）和 100 mmol/L。

给定两组底物浓度，加入定量脂肪酶，测定不同抑制剂浓度下酶反应的残余酶活，求出各反应速率，并算出速率的倒数。用反应速率倒数和抑制剂浓度按 Dixon作图法作图，结果如图 5所示。

图5 抑制作用的 Dixon图Figure 5 The Dixon map of inhibition

根据图 5两直线的交点，从横轴坐标上读出抑制常数 –Ki=–2.7×10-7mol/L，则 Ki=2.7× 10-7mol/L。Dixon图和 Lineweaver-Burk图的特征表明，3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素对脂肪酶的抑制呈非竞争性抑制。

3 讨论

通过采用铜皂法测得 3'，4'，5，7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素 IC50为 3.17×10-7mol/L，通过研究其对碱性脂肪酶的抑制机制发现：抑制剂是与酶的活性部位以外的基团作用而反过来影响酶活性部位与底物的结合，从而导致酶活性降低，酶促反应速率变小。结果表明碱性脂肪酶的米氏常数 Km= 100 mmol/L，脂肪酶抑制剂的抑制常数 Ki=2.7× 10-7mol/L。Dixon图和 Lineweaver-Burk图的特征都证明该抑制机制为非竞争性抑制。

此类型抑制作用的特点是底物和抑制剂同时和酶结合，两者没有竞争抑制作用。酶与抑制剂结合后，还可以与底物结合；酶与底物结合后，还可以与抑制剂结合形成中间三元复合物，这种三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶的催化活性降低。这类抑制剂与酶的活性部位以外的基团相结合，其结构与底物无共同之处，这种抑制作用不能通过增加底物浓度来解除抑制。

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Method Theimproved coppersoap method waschoosed to determinetheactivity oflipasewith3'，4'，5，7-four （2-ethyl-phosphoryl）-luteolin as inhibitors.It was used to measure the relationship between the concentration of 3'，4'，5，7-four （2-ethyl-phosphoryl）-luteolin and the lipase activity to work out the effect of the compound on lipase activity，and calculate its IC50.

Result The inhibition effect of the compound on the activity of alkaline lipase was non-competitive inhibition，the IC50=3.17× 10-7mol/L，Km=100 mmol/L，and Ki=2.7×10-7mol/L.

Conclosion The inhibitory effect of the compounds on alkaline lipase is non-competitive，which results from interaction with the groups outside the activation site and leads to the decrease of enzyme activity.

Study on the mechanism of alkaline lipase activity influenced by 3'，4'，5，7-four（2-ethyl-phosphoryl）-luteolin

CHEN Yu-bao，HU You-fan，XIONG Fang-qi，LIU Xin，PENG Guo-ping

Objective To study the effect of flavonoid compounds on alkaline lipase activity.

3'，4'，5，7-four（2-ethyl-phosphoryl）-luteolin；Enzyme inhibitors；IC50

PENG Guo-ping，Email:pgphh@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.009

410128长沙，湖南农业大学生物科学技术学院

彭国平，Email：pgphh@163.com

2014-11-10

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术，2015，10（2）:144-148

AuthorAffiliation:College of Biological Science and Technology，HunanAgricultural University，Changsha 410128，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:144-148