蔡秀清，刘丹丹，宿世杰，王乐乐，贾传礼，许金俊，陶建平

（扬州大学兽医学院 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建

蔡秀清，刘丹丹，宿世杰，王乐乐，贾传礼，许金俊，陶建平

（扬州大学兽医学院 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

本文采用Trizol试剂提取毒害艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA，用oliogo（dT）磁珠法纯化mRNA后，采用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA噬菌体表达文库。经鉴定，原始文库容量为2.14×106pfu/mL，扩增后的文库容量为4.47×1010pfu/mL，扩增文库的重组率为90%。随机挑取100个单克隆，通过菌液PCR检测得知文库插入片段长度以400～1000 bp为主。本研究结果为毒害艾美耳球虫新基因的筛选和功能研究奠定了基础。

毒害艾美耳球虫；第二代裂殖子；cDNA文库

鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生性原虫病，世界所公认的病原有7种。临床上，大多数虫种主要危害3～6周龄的雏鸡，而毒害艾美耳球虫（Eimeria necatrix）常危害8～18周龄的鸡，引起鸡的急性小肠球虫病［1］。目前，鸡球虫病的防治主要依赖化学药物或鸡球虫病活疫苗，虽然人们采取了穿梭用药、轮换用药、联合用药等各种措施，但球虫几乎对所有使用过的抗球虫药物均出现了耐药性。鸡球虫病活疫苗有着较强的免疫效果，但存在一些突出的问题，如有扩散病原的风险，疫苗接种剂量难以控制，影响饲料报酬等［2，3］。因此，鸡球虫保护性抗原基因的分离鉴定以及基因工程疫苗的研究一直是鸡球虫病研究的热点。

艾美耳球虫的生活史包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三个发育阶段，其中裂殖生殖又经历2～3代［1］。球虫的抗原不仅具有种特异性，还有虫体发育阶段特异性。研究显示，毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖生殖阶段对再感染能产生最强的抵抗力［4］。因此，分离鉴定毒害艾美耳球虫第二代裂殖生殖阶段的功能性抗原基因显得尤为重要。

cDNA文库是以特定组织或细胞的mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA与适当的载体连接后转化受体菌形成的重组DNA克隆群。它可以特异地反映某种组织或细胞在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态以及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势［5］。Tajima等［6］利用鸡阳性血清从毒害艾美耳球虫裂殖子cDNA中筛选出一个与柔嫩艾美耳球虫基因（Mzp5-7）同源的pNP19基因，其体外表达的重组蛋白能特异性识别毒害艾美耳球虫致弱株或强毒株免疫的鸡血清。卞庆松等［7］成功构建了毒害艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库。本研究利用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫第二代裂殖子阶段的cDNA文库，为筛选该虫种的功能性基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫株 毒害艾美耳球虫扬州株由扬州大学兽医学院寄生虫学教研室建株并保存。试验前经鸡体传代复壮。

1.2 实验动物 黄羽鸡购自中国农科院家禽研究所育种中心，雏鸡出壳后即运回实验室，饲养在无球虫环境中，自由采食和饮水。

1.3 主要试剂 Trizol试剂购自Invitrogen公司；SMART cDNA文库构建试剂盒购自Clontech公司；GigapackⅢ Gold Packaging Extract购自TaKaRa公司；mRNA分离试剂盒购自TaKaRa公司；1 kb DNA Marker、DL2000 DNA Marker购自Fermentas公司；其他所用试剂均购自上海生物工程技术服务有限公司。

1.4 第二代裂殖子的分离与纯化 28日龄无球虫雏鸡，每羽鸡经嗉囊感染20 000个毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。感染后150 h剖检，取小肠中段，按文献［8］报道的方法分离纯化裂殖子。

1.5 第二代裂殖子总RNA提取与mRNA的分离与纯化 将冻存于液氮中的毒害艾美耳球虫第二代裂殖子迅速取出100 μL（约108个裂殖子），加入1 mL Trizol试剂，置于匀浆器中匀浆后，按Trizol试剂说明书提取总RNA。经1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性后，用Nanodrop-2000紫外分光光度计测定其含量和纯度。按TaKaRa公司mRNA试剂盒说明书分离纯化mRNA，用1%琼脂糖凝胶变性电泳进行检测其状况。

1.6 cDNA文库的构建

1.6.1 第一链cDNA的反转录合成 总体系为10 μL：模板mRNA 3 μL、SMART IVTM寡核苷酸引物1 μL、CDSⅢ3'引物1 μL。72℃孵育2 min后，迅速冰浴2 min，再加入第一链反应物Power ScriptTM反转录酶1 μL、10 mmol/L dNTP混合液1 μL、20 mmol/ L DTT 1 μL、5×第一链合成缓冲液2 μL。混匀后42℃ 1 h后置冰上5 min终止反应。

1.6.2 第二链cDNA的LD-PCR合成 总体系为100 μL：第一链cDNA反应产物2 μL、去离子水80 μL、10×Advantage PCR buffer 10 μL、50×dNTP Mix 2 μL、5' PCR Primer 2 μL、3' PCR Primer 2 μL、50×Advantage Polymerase Mix 2 μL。反应条件：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，68℃退火6 min，30个循环。反应结束后取10 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6.3 蛋白酶K的消化 取50 μL第二链cDNA（约2～3μg），按照说明书进行蛋白酶K的消化。加入79 μL去离子水溶解沉淀，进行下一步实验，或-20℃保存备用。

1.6.4 SfiⅠ酶切消化 总体系为100 μL：cDNA 79 μL、10×SfiⅠBuffer 10 μL、SfiⅠEnzyme 10 μL、100×BSA 1 μL。50℃水浴2 h，然后加入2 μL 1%的二甲苯氰蓝，混匀备用。

1.6.5 cDNA的分离纯化 将上述SfiⅠ酶切消化后的cDNA（100 μL）全部上样于CHROMA SPIN-400TM柱，每管1滴（约35 μL），每管取5 μL收集液进行1%琼脂糖凝胶变性电泳，150V电泳10 min，检测各管片段的大小，收集出现DNA片段的前3管约含140μL的cDNA片段，纯化回收后，加入7 μL去离子水溶解，用于载体连接。

1.6.6 cDNA与λTriplEx2载体连接与体外包装 以体积比为1.5∶1的体系加入cDNA和λTriplEx2TM载体，16℃连接过夜。然后取4 μL连接产物与1管包装蛋白混合，22℃水浴2 h，加入500 μL SM buffer和20 μL氯仿，温和混匀，收集含有噬菌体的上清，即为构建的cDNA原始文库。

1.7 cDNA文库的鉴定

1.7.1 初始cDNA文库容量的测定 取初始cDNA文库1μL分别作1∶10、1∶100、1∶1000稀释，然后各取1 μL稀释液加至200 μL过夜培养的XL1-BLUE悬液中，37℃吸附10～15 min，再加入2 mL LB Top agar（45℃左右）混匀铺平板，37℃培养过夜，d2计算平板上的噬菌斑。文库滴度（pfu/mL）=（噬菌斑数×稀释倍数×103μL/mL）/涂板噬菌体体积（μL）。

1.7.2 cDNA文库的扩增和效价测定 将原始文库在直径为150 mm LB/MgSO4培养基平板上扩增，37℃培养6～18 h，避免噬菌体的污染。每个平板加12 mL 1×Lambda dilution buffer，4℃保存过夜。收集噬菌体液体，加入10 mL氯仿，混匀后离心，收集上清备用。如果长期保存可加入7%的DMSO，-70℃保存，避免反复冻融。将扩增的cDNA文库按梯度平铺于90 mm的LB/MgSO4平板上，计算噬菌斑的个数，方法同上。

1.7.3 cDNA文库插入片段大小及重组率的测定 随机挑取扩增文库上的100个噬菌斑，置于0.5 mL离心管中，加入50 μL 1×Lambda dilution buffer和2 μL氯仿，4℃过夜。进行PCR检测。上游引物为：5'-TCCGAGATCTGGACGAGC-3'；下游引物为：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；反应体系为20 μL：ddH2O 13.5 μL、10×PCR buffer 2 μL、上游引物（25μmol/mL）0.75 μL、下游引物（25μmol/mL）0.75 μL、2.5 mmol/L的 dNTP 1.5 μL 、TaKaRa rTaq 0.5 μL、噬菌斑模板1 μL。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54.5℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环。反应结束后，取10 μL产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小和重组率。

2 结果

2.1 毒害艾美耳球虫第二代裂殖子的分离与纯化 从50羽鸡的小肠中段卵黄蒂前后黏膜中纯化裂殖子，通过酶消化，离心洗涤，红细胞裂解和Percoll密度梯度离心后得到2 mL沉淀物，经显微镜观察，裂殖子活性好，形态完整，无杂质（图1）。

图1 纯化的毒害艾美耳球虫第二代裂殖子Fig.1 The second generation merozoites of E. necatrix

2.2 第二代裂殖子总RNA的提取和mRNA的分离 提取的毒害艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA，经Nanodrop-2000紫外分光光度计测定其OD260/ OD280=2.12，含量为3817.2 ng/μL。电泳检测显示，可见明显的28 S、18 S条带（图2），由总RNA分离得到的mRNA经变性电泳检测，可看到分布在250～2500 bp之间的一片模糊的条带（图3），用Nanodrop-2000紫外分光光度计测定其浓度为50 ng/μL。

2.3 双链cDNA的合成 合成的双链cDNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示cDNA的大小集中在250～1000 bp（图4），符合cDNA合成的分布规律。

2.4 cDNA文库的鉴定 经计算，原始文库容量（pfu/ mL）=［214（噬菌斑数）×10（稀释倍数）×103μL/ mL］/1μL（涂板噬菌体体积）=2.14×106pfu/ mL，扩增后的文库容量（pfu/mL）=4.47（噬菌斑数）×106（稀释倍数）×103μL/mL/10 μL（涂板噬菌体体积）=4.47×1010pfu/ mL。电泳和片段大小统计结果表明扩增文库的重组率为90%，插入片段集中在400～1000 bp（图5）。

M： DNA 分子量标准（DL1000）； 1： 毒害艾美耳球虫总RNAM： DNA Marker（DL1000）； 1： Total RNA of E. necatrix

M： DNA 分子量标准（DL1000）； 1： 分离的mRNAM： DNA Marker（DL1000）； 1： mRNA products

3讨论

在cDNA文库的构建中，总RNA和mRNA的质量是实验成功的先决条件。目前，提取总RNA的方法主要有氯化铯离心法、Trizol法、异硫氰酸胍等方法［9，10］。本研究采用Trizol法提取总RNA，结果显示提取物在1%琼脂糖凝胶变性电泳时28 S、18 S条带清晰，无拖带现象，产量高达3817.2 ng/μL，其OD260/OD280比值大于2.0，表明提取的总RNA纯度高，基本无蛋白和其他杂质污染。从总RNA中分离纯化的mRNA，经检测在250～2500 bp看到一条模糊的条带，表明mRNA的质量符合有效文库的标准。

根据一般文库的构建标准：未扩增文库滴度达1.0×106pfu/mL，试剂盒所提供的对照片段重组率达80%以上，所建文库即为有效文库。本研究用SMART方法构建的毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库，经检测原始文库的容量为2.14×106pfu/ mL，扩增后的文库容量为4.47×1010pfu/mL，扩增文库重组率为90%，通过随机PCR扩增得知插入片段大小在400 ～1000 bp内，达到SMART有效文库的构建指标。

目前，国内外已成功构建了多个鸡球虫的cDNA文库［11-14］，并从文库中筛选出了目的片段或基因。卞庆松等［7］构建了毒害艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库，并利用免疫学方法，或将整个文库转化为质粒文库，成功地筛选出了基因片段。Binger等［15］用兔抗柔嫩艾美耳球虫裂殖子表面抗体，从文库中筛选出了λMZ5-7片段。Brothers等［16］利用抗体筛选出柔嫩艾美耳球虫Ta4基因片段，并克隆出该基因的全长序列。Refega等［17］从柔嫩艾美耳球虫第一代裂殖体和子孢子文库中筛选到的阳性克隆，经鉴定为热休克蛋白、核糖体蛋白和丙酮酸激酶基因。迄今为止，毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的研究仅见Tajima等［6］相关报道，因此本文库的成功构建将为筛选新基因和研究毒害艾美耳球虫基因工程疫苗提供新的研究思路。

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CONSTRUCTION OF A CDNA LIBRARY FOR THE SECOND GENERATION OF MEROZOITES OF EIMERIA NECATRIX

CAI Xiu-qing， LIU Dan-dan， SU Shi-jie， WANG Le-le， JIA Chuan-li， XU Jin-jun， TAO Jian-ping
（Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

In order to construct a cDNA library for the second generation of merozoites of Eimeria necatrix， the whole RNA was extracted using Trizol reagent and the mRNA was purified using the beads with oligo（dT）. Then， the cDNA library was constructed based on SMART technique. The results showed that the capacity of the unamplifi ed library was 2.14×106pfu/mL and the capacity of the amplifi ed library was 4.47×1010pfu/mL. The amplifi ed library recombination rate was 90%. According to the PCR amplifi cation from 100 monoclonal colonies that were picked randomly， the sizes of amplifi ed fragments were mostly between 400 bp to 1000 bp. The cDNA library constructed in the present study provided a basis for screening， cloning and further studies of new genes of E. necatrix.

Eimeria necatrix； merozoites； cDNA library

S852.723

A

1674-6422（2015）05-0065-05

2015-06-04

国家自然科学基金（31472181）；江苏省属高校自然科学基金重大项目（11KJA230002）；高等学校博士学科点专项科研基金（20123250110002）；江苏高校优势学科建设工程项目；中央财政支持地方高校发展项目

蔡秀清，女，硕士，主要从事兽医寄生虫与寄生虫病学研究

陶建平，E-mail：yzjptao@126.com