宋凯杰，陈宗艳，黄云秀，3，李传峰，孟春春，李丹丹，张淼涛，刘光清

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2. 西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；3. 广西大学动物科学技术学院，南宁 530005）

鸭TLR3基因胞外区的原核表达及抗体制备

宋凯杰1，2，陈宗艳1，黄云秀1，3，李传峰1，孟春春1，李丹丹1，2，张淼涛2，刘光清1

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2. 西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；3. 广西大学动物科学技术学院，南宁 530005）

采用PCR方法扩增鸭TLR3基因胞外区，将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）中，转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，经IPTG诱导后，表达重组TLR3蛋白，并从包涵体中纯化重组蛋白。结果显示，PCR扩增得到972 bp的TLR3基因胞外区，用纯化的重组TLR3蛋白免疫实验兔，制备TLR3的多克隆抗体，用Western blot和ELISA检测其特异性及效价。本研究成功表达了TLR3基因胞外区，用该蛋白免疫实验兔后，制备的多抗能与TLR3特异性反应。

TLR3；胞外区；原核表达；多克隆抗体

天然免疫系统是机体抵御外来病原体的第一道防线。宿主细胞表达多种多样模式识别受体（pattern recognition receptor， PRR）来感受病毒的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），包括识别病原体的脂质、脂蛋白、蛋白和核酸。PRR识别PAMP后激活胞内的信号通路，最终引起细胞产生炎症因子、趋化因子、干扰素和一些共刺激分子的上调［1］。Toll样受体属于Ⅰ型跨膜蛋白，胞外的亮氨酸富含区域负责识别病原体的PAMP，胞质区与IL-1受体同源，称为TIR区，负责下游的信号转导［2］。随着对水禽类Toll样受体的不断深入研究，在鸭中已有6种Toll样受体被发现，包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4和TLR7［3-7］。其中TLR3负责识别双链RNA，通过TRIF接头蛋白激活IKKε和TBK1激酶，这些激酶活化IRF3和IRF7后，促使核转录因子NF-ΚB转位和诱导IFN-α、IFN-β、细胞因子的产生，起到抗病毒作用［8］。

研究发现，番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）感染番鸭后，TLR3、IFN-α、IFN-β的表达量随着感染天数增加先上升后下降，这说明TLR3对双链RNA病毒产生了应答，从而证实TLR3参与番鸭抵抗MDRV感染反应［9］。北京鸭与番鸭同属于鸭科，番鸭属于栖鸭属（Cairina）的疣鼻栖鸭（Cairina moschata）家族，而北京鸭属于绿头鸭属（Anas platyrhynchos），番鸭的TLR3基因结构及功能已有报道［4］，而有关北京鸭的TLR3基因功能研究甚少。对北京鸭TLR3基因结构和功能进行研究，对于解析鸭重要疾病的发生传播机制及机体免疫应答具有重要意义，同时也可以丰富鸭科天然免疫受体库的研究。本研究在从北京鸭外周血单个核细胞中成功扩增出TLR3基因基础上，表达了TLR3胞外区，并制备了其特异性多克隆抗体，为研究TLR3功能奠定了物质基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 Trans5α和BL21（DE3）感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司；重组质粒pEASY-Blunt5-TLR3由中国农业科学院上海兽医研究所刘光清课题组构建并且保存［10］；pET-32a（+）载体购自Novagen公司。

1.2 主要试剂 PFU高保真酶购自Tiangen公司；T4连接酶购自Promega公司；BamHⅠ 和XhoⅠ 限制性内切酶购自TaKaRa公司（大连）；二氨基联苯胺显色色液购自武汉博士德公司；抗His标签鼠单克隆抗体购自北京康为世纪公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自中杉金桥公司（北京）；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自购自BioTake公司。

1.3 TLR3基因的扩增 根据GenBank中北京鸭TLR3基因序列（登录号：KM434239）设计扩增胞外区基因的引物。TLR3-F：5'- cgGGATCCtctaactgcaacataaac-3'（下划线核苷酸为BamHⅠ识别位点）； TLR3-R：5'- ccCTCGAGagtagtgatcataaacag-3'（下划线核苷酸为XhoⅠ 识别位点），预期扩增产物长度为972 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。以本实验室之前构建的pEASY-Blunt5-TLR3质粒为模板，用2× pfu DNA聚合酶扩增TLR3基因，PCR反应体系：模板DNA（200 ng/μL）0.1 μL，pfu Mix 25 μL，上、下游引物（10 pmol/uL）各1 μL，加灭菌蒸馏水至50 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃终延伸10 min。同时设立阴性对照，不加模板。取PCR扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，切胶并用BioTake公司凝胶回收试剂盒纯化回收。

1.4 重组表达质粒的构建与鉴定 将纯化的TLR3基因和pET-32a（+）载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，然后用T4 DNA连接酶连接，再转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，用氨苄抗性的平板筛选阳性克隆，提取重组质粒，用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切进行鉴定后，交由上海美吉生物公司测序，将鉴定正确的重组质粒命名为pET-32a/TLR3。

1.5 TLR3基因的诱导表达 将pET-32a/TLR3转化至E.coil BL21（DE3）感受态细胞中，经氨苄抗性筛选后，挑取单克隆于LB培养基中，于37℃培养至OD600为0.8时，加入IPTG（终浓度为1.0 mmol/L）诱导后，分别于培养2、4、6、8、10 h后收集菌液1 mL，4℃、1000×g离心5 min，收集菌体沉淀，取合适菌量与5倍浓度上样缓冲液混匀，100℃煮沸10 min，进行SDS-PAGE电泳分析。

1.6 TLR3融合蛋白的纯化 小量收集鉴定菌液培养，称量菌体湿重，每克菌体加入3mL细胞裂解缓冲液Ⅰ，轻轻用玻璃棒使菌体悬起，每克湿重加入4 μL 100 mmol/L PMSF和80 μL 10 mg/mL溶菌酶，37℃搅动20 min，超声破碎直至不粘稠，超声波工作电压400 V，工作5 s，间隔5 s，于4℃、10 800×g离心10 min，分别取上清和菌体沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，以确定TLR3的表达形式。之后，扩大培养表达TLR3的重组菌，诱导表达TLR3蛋白。参照分子克隆实验指南［11］，从包涵体中纯化蛋白，对纯化产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定，使用的一抗为抗His标签的鼠单克隆抗体。

1.7 抗TLR3多克隆抗体的制备 健康新西兰大白兔饲养1w后进行首次免疫，免疫剂量为1 mg纯化后的重组蛋白，与等体积弗氏完全佐剂完全乳化后皮下多点注射。2周后进行第2次免疫，免疫剂量为1 mg纯化后的重组蛋白，与等体积弗氏不完全佐剂完全乳化后皮下多点注射。此后每隔1周免疫1次，剂量与方法同第2次免疫。第4次免疫后于d5耳缘静脉采血，检测抗体效价。抗体效价达到一定数值后进行加强免疫，免疫剂量为1 mg纯化后的重组蛋白，耳缘静脉注射。加强免疫后d7，颈动脉采血，离心制备血清，分装后于-20℃保存

1.8 间接ELISA方法测定多克隆抗体效价 重组的蛋白包被ELISA板（1 μg/孔），4℃过夜，用5%脱脂乳37℃封闭2 h；PBST洗涤3次。将兔抗TLR3多克隆抗体按照倍比法用PBS稀释（按1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12 800的比例稀释，每个稀释度设立3个复孔），37℃ 孵育1 h；PBST洗涤3次，以羊抗兔IgG/HRP作为二抗37℃孵育45 min；PBST洗涤3次后，加入TMB避光显色，最后加浓硫酸终止反应；阴性血清按照1∶100稀释，同时设立PBS空白对照孔。运用酶标仪在波长450 nm处读取OD450值。各孔OD450和阴性对照孔OD450的比值（P/ N）大于2.1作为确定效价的临界点。效价以P/N大于2.1的血清最大稀释倍数表示。

1.9 Western blot检测多克隆抗体特异性 第4次免疫后1周，兔心脏采血，分离血清，-80℃分装后保存。以TLR3融合蛋白为抗原，Western blot检测多克隆抗体的特异性，待检血清按照1∶200倍稀释作为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，二氨基联苯胺法显色观察出带情况。

2 结果

2.1 重组表达质粒的鉴定 以pEASY-Blunt5-TLR3质粒为模板，成功扩增出TLR3胞外区基因，其长度为972 bp，与预期结果相符。将其进行双酶切后，将其插入到pET-32a（+）载体中，得到了pET-32a/ TLR3。进一步酶切鉴定和序列测定结果表明，成功构建了含有TLR3基因序列的重组表达质粒。

2.2 TLR3胞外区蛋白表达、优化及纯化 pET-32a/ TLR3转化E.coLi BL21（DE3）感受态细胞后，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L进行诱导，并取不同时间点的重组菌液查看表达情况，结果表明诱导4～6 h可使TLR3融合蛋白得到最大表达。TLR3蛋白为36 kDa，His标签蛋白为19 kDa（图1），与预期结果一致。TLR3蛋白优化结果发现，IPTG诱导6 h后，蛋白表达量达到最大。可溶性分析结果表明，在重组菌沉淀和菌体裂解上清液中均能检测到TLR3重组蛋白，但以沉淀中居多，说明TLR3主要以包涵体形式存在（图2）。

图1 鸭TLR3胞外区重组蛋白的诱导表达结果Fig.1 Expression of the extracellular domain of duck TLR3

图2 鸭TLR3胞外区重组蛋白的可溶性分析Fig.2 Soluble analysis of the extracellular domain ofduck TLR3

2.3 重组蛋白TLR3多抗的鉴定与效价测定 将纯化后的TLR3蛋白分4次免疫实验兔，得到抗TLR3的高免血清，即多克隆抗体。为了检测抗体的特异性，将纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后将蛋白转印到2份PVDF膜上，转印条件均为：10 V、30 min。一张NC膜使用的一抗为His标签鼠单克隆抗体为（1∶2000稀释）（图3A），二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶2000稀释）；另一张NC膜孵育一抗（1∶1000稀释）为本试验制备的抗TLR3多克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG（1∶2000稀释）（图3B）。Western blot检测两张NC膜的结果均发现在约55 kDa处出现特异性反应带，说明制备的多抗具有反应原性。间接ELISA法测定结果表明，经过4次免疫，兔血清抗体效价达到1∶6400以上，表明原核表达的重组蛋白可诱导动物产生良好的体液免疫反应（图4）。

3 讨论

图3 Western blot鉴定重组蛋白结果Fig. 3 Identifi cation of the extracellular domain of duckTLR3 with Western blot

图4 兔抗鸭TLR3胞外区多抗的ELISA效价图Fig.4 ELISA titer analysis of the polyclonal antibodies against the extracellar domain of duck TLR3

级结构均能被TLR3识别［12］。有报道称TLR3能够识别存在于吞噬细胞内病毒产生的双链RNA［13］。由此可见，TLR3在病毒感染过程中起到了至关重要的作用。鸭TLR3基因开放阅读框为2688 bp，编码895个氨基酸，富含17.0 %亮氨酸，该分子属于Ⅰ型跨膜受体，运用生物信息预测软件［14］发现其由胞外区（aa1～aa695）、跨膜区（aa696～aa718）和胞内区（aa719～aa895）3部分组成，N端含有一个信号肽序列，胞外富含18个亮氨酸重复序列（leucine rich

对于大多数病毒来说，包括DNA病毒，在复制周期内会产生双链RNA中间产物，这些RNA的二repeats，LRR），胞内含有Toll/IL-1R同源区结构域。胞外区负责识别病原体，胞内TIR区负责下游信号转导。研究发现胞外的亮氨酸富含区域在识别配体和信号转导功能方面起重要作用，它们含有一致的基序L（X2）LXL（X2）NXL（X2）L（X7）L（X2），其中X代表任何氨基酸［15］。TIR区是非常保守的区域，介导蛋白与蛋白之间的互作，在动物和植物的胞质内或胞膜上均被发现［16］。鸭TLR3蛋白全长难以表达，出于TLR3蛋白胞外区负责识别病原体的考虑，本研究进行了鸭TLR3胞外区多抗体的制备。将纯化的重组蛋白与佐剂混合后，免疫新西兰大白兔，得到兔抗鸭TLR3多抗，经间接ELISA测定多克隆抗体效价为1∶6400；Western blot分析结果显示，该抗体具有良好的反应性和特异性。本研究首次制备了鸭TLR3胞外区片段多抗，具有良好的反应性，为后续研究鸭TLR3蛋白功能提供了良好的技术材料平台。

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND ANTIBODY PREPARATION OF THE EXTRACELLULAR DOMAIN OF DUCK TOLL-LIKE RECEPTOR 3

SONG Kai-jie1，2， CHEN Zong-yan1， HUANG Yun-xiu1，3， LI Chuan-feng1， MENG Chun-chun1，LI Dan-dan2， ZHANG Miao-tao2， LIU Guang-qing1
（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. College of Veterinary Medicine， Northwest A&F University，Yangling 712100， China； 3. College of Animal Sciences and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China）

To study the function of duck TLR3， prokaryotic expression plasmid of Beijing duck Toll-like receptor 3 （Toll-like receptor 3， TLR3） gene was constructed and expressed in E. coli BL21 （DE3）. The obtained TLR3 protein was purifi ed from inclusion body and its polyclonal antibodies were prepared. The extracellular domain of duck TLR3 gene was amplifi ed with PCR and the resulting 972 bp fragment was cloned into expression vector pET-32a （+）. The recombinant plasmid pET-32a/TLR3 was then transformed into E.coli BL21（DE3） for expression with induction of IPTG. Duck TLR3 protein was purifi ed from the obtained inclusion body. The recombinant protein was used to vaccinate rabbits to prepare polyclonal antibodies. The antiserum samples were collected and examined with Western blot and ELISA， demonstrating its specifi city and reactivity.

Toll-like receptor 3； extracellular domain； prokaryotic expression； polyclonal antibody

S852.42

A

1674-6422（2015）05-0070-05

2015-05-07

上海市科委创新项目（13391901602）；国家自然科学基金项目（31270194、31101848、31502068）；农业部公益性行业科研专项（201303046）

宋凯杰，男，硕士研究生，预防兽医学专业

刘光清， E-mail：liugq@shvri.ac.cn.；张淼涛，副教授，E-mail：zmt6371@yahoo.com.cn