李化东，黄显明，卢凤英，丁美娟，张小飞

（1. 安徽农业大学动物科技学院，合肥 230061；2. 南京天邦生物科技有限公司，南京 211102）

血清1型和3型鸭甲型肝炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立

李化东1，2，黄显明2，卢凤英2，丁美娟2，张小飞2

（1. 安徽农业大学动物科技学院，合肥 230061；2. 南京天邦生物科技有限公司，南京 211102）

根据鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）的基因序列，设计了2对特异性引物，分别建立检测鸭甲型肝炎病毒血清1型（DHAV-1）和鸭甲型肝炎病毒血清3型（DHAV-3）的RT-PCR方法。通过对PCR扩增条件优化建立了鉴别血清1型和血清3型DHAV的二重RT-PCR检测方法，DHAV-1和DHAV-3目的片段大小分别为751bp和448bp，而且对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验表明该检测方法最低检测量为10 pg的DHAV-1和8 pg的DHAV-3模板。因此，本研究建立的二重RT-PCR检测方法可用于DHAV-1和DHAV-3感染的临床样品的快速鉴别诊断。

鸭甲肝病毒血清1型；鸭甲肝病毒血清3型；二重RT-PCR

由鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起的鸭肝炎自20世纪50年代在美国被发现以后，迅速在世界养鸭地区爆发和蔓延，成为危害我国养鸭业最严重的疫病。2002年苏敬良等［1］报道北京市和广西壮族自治区等地免疫过鸭肝炎疫苗或注射过鸭肝炎高免卵黄抗体的鸭群仍然发生鸭肝炎，并且证明分离到的鸭肝炎病毒与经典的鸭肝炎病毒无血清学交叉反应，故暂称新型鸭肝炎病毒。2007年，台湾学者Tseng［2］和韩国学者Kim［3］分别分离到不同于经典的鸭肝炎病毒的新型鸭肝炎病毒。通过分子生物学和血清学鉴定表明，台湾和韩国分离的新型鸭肝炎病毒均属DHAV，但他们之间也存在着明显的血清学差异。现已明确将DHAV分为3个血清型［4］，即经典的鸭肝炎病毒、台湾新型鸭肝炎病毒和韩国新型鸭肝炎病毒分别对应血清1型DHAV（DHAV-1）、血清2型DHAV（DHAV-2）和血清3型DHAV（DHAV-3）。

在我国，随着针对DHAV-1活疫苗和高免卵黄抗体的应用，DHAV-1引起的鸭肝炎已得到有效控制，但由于近十年来新出现的DHAV-3引起的鸭肝炎又成为制约我国养鸭生产新的严峻问题。本研究建立的同时检测DHAV-1和DHAV-3二重RT-PCR方法，为临床诊断和检测DHAV-1和DHAV-3感染提供了快速适用的技术手段。

1 材料和方法

1.1 材料 新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck revovirus， NDRV）、鸭坦布苏病毒（Duck tembusu virus，DTMUV）、鸭瘟病毒（Duck plague virus， DPV）、血清1型鸭甲型肝炎病毒A66株（DHAV-1）和血清3型鸭甲型肝炎病毒分离株（DHAV-3）均由南京天邦生物技术研究所实验室保存；抗DHAV-1、DHAV-3血清由本实验室制备提供。2013年8月～2014年6月，采集于山东省、江苏省和安徽省等地鸭场疑似鸭肝炎的肝脏病料11份，-20℃保存。

1.2 试剂 病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒购自Biomed生物公司；AMV反转录酶、RNA酶抑制、dNTP、Ex-Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）、pMD18-T载体均购自TaKaRa公司。

1.3 引物设计与合成 根据DHAV-1 A66株（GenBank登录号：DQ886445）和DHAV-3 JS2010株（GenBank登录号：HQ654774）全基因组序列，应用Primer Premier 5.0软件分别设计了2对鉴定引物，特异性扩增DHAV-1鉴定引物P1 /P2和DHAV-3鉴定引物P3 /P4，引物由上海生物工程有限公司合成，见表1。

表1 二重RT-PCR引物序列Table 1 Duplex PCR primers sequences

1.4 RNA提取 将DHAV-1和DHAV-3尿囊液按照Biomed生物公司的病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒提取RNA，加入适量的DEPC处理水溶解。

1.5 二重RT - PCR检测方法的建立及优化 参考AMV说明书操作进行反转录，以cDNA为模板进行PCR扩增，采用25 μL体系，对退火温度从50℃～60℃进行优化，再以最佳退火温度对引物浓度（0.5、1.0、1.5、2 μmol/mL）及反应体系进行反应条件的优化。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物经回收纯化，连接至pMDl8-T载体进行克隆，然后送上海生物工程有限公司进行测序。

1.6 特异性试验 采用建立的二重RT-PCR方法分别检测NDV、NDRV、DTMUV、DPV、DHAV-1、DHAV-3与DHAV混合物，以检测其特异性。

1.7 敏感性试验 将提取的DHAV-1和DHAV-3的cDNA用紫外分光光度仪分别测定其含量，然后分别进行10倍系列稀释，将系列稀释的cDNA作为模板进行二重RT-PCR扩增，以检测其敏感性。

1.8 临床样品的检测 对11份华东部分地区临床疑似DHAV感染病鸭的肝脏病料进行二重RT-PCR检测。

1.9 临床样品的病毒分离鉴定 将上述11份临床肝脏病料样品，用灭菌生理盐水按1∶5（W/V）匀浆、离心和除菌过滤处理后，经尿囊腔接种10日龄鸭胚进行病毒分离，盲传3代，收获死胚胚体和尿囊液，采用DHAV-1、DHAV-3特异性血清进行鸭胚中和试验鉴定分离病毒。

2 结果

2.1 二重RT-PCR检测方法的建立及优化 通过对引物浓度、退火温度以及反应体系等反应条件的反复优化，最终确定，反应体系为25 μL：DHAV-1和DHAV-3的等量混合模板2 μL，DHAV-1、DHAV-3上下游引物各0.5 μmol/mL，Taq酶预混剂12.5 μL，加灭菌ddH2O补足体积至25 μL。循环参数：94℃预变性4 min；94℃变性 40 s，53℃退火 40 s，72℃延伸40 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。DHAV-1和DHAV-3分别扩增出约751 bp和448 bp片段，与预期大小一致。测序结果经序列比对分析表明，扩增的目的片段与DHAV-1 CH2010和DHAV-3 JS2010等相应序列同源性分别为100%。

2.2 特异性试验 特异性检测结果显示，只有DHAV-1和DHAV-3能够分别扩增出约751 bp和448 bp的特异性条带，而NDV、NDRV、DTMUV、DPV均未扩增出条带，结果见图1。

图1 二重RT-PCR方法的特异性检测Fig.1 Specifi city test of the duplex RT-PCR

2.3 敏感性试验 结果显示建立的二重RT-PCR方法对DHAV-1和DHAV-3的核酸最低检出量分别为10 pg和8 pg，结果见图2。

图2 二重RT-PCR方法的敏感性试验Fig.2 Sensitivity test of the duplex RT-PCR

2.4 临床样品检测 采用二重RT-PCR方法对11份华东部分地区临床上各鸭场疑似DHAV感染病鸭肝脏病料进行RT-PCR检测。结果检出DHAV-1阳性病料1份（1/11），DHAV-3阳性病料7份（7/11），同时检出DHAV-1和DHAV-3的阳性病料2份（2/11），1份病料检测为阴性（1/11），结果见图3。

图3 二重RT-PCR检测临床样品结果Fig.3 The detection rusults of DHAV-1 and DHAV-3 inclinical samples by duplex RT-PCR

2.5 临床样品的病毒分离和鉴定 将11份疑似DHAV病鸭肝脏等病料接种10日龄鸭胚后，进行病毒分离，结果显示二重RT-PCR阳性的病料经鸭胚病毒分离均成功分离到DHAV（10/10），1份PCR检测阴性的病料未分离到病毒。采用抗DHAV-1、DHAV-3特异性血清对分离病毒进行鸭胚中和试验进行病毒鉴定，结果1份RT-PCR检测DHAV-1阳性病料的分离病毒能被抗DHAV-1血清中和，7份RT-PCR检测DHAV-3阳性病料的分离病毒能被抗DHAV-3血清中和，2份RT-PCR检测DHAV-1和DHAV-3混合感染的阳性病料，经交叉中和试验证明分离物中含有DHAV-1和DHAV-3的分离病毒。结果表明，构建的DHAV二重RT-PCR检测方法与病毒分离鉴定结果具有高度一致性。

3讨论

近年来，随着国内DHAV-3的出现，DHAV-1和DHAV-3在部分地区共流行，同时DHAV-1和DHAV-3的流行病学、临床症状、病理变化相似，这些均给国内鸭甲型肝炎的预防和诊断带来了困难［5］，有关RT-PCR检测方法的研究报道较多，但同时检测DHAV-1和DHAV-3的二重RT-PCR的相关报道甚少［6，7］。Kim等［8］建立的DHAV-1和新型鸭肝炎的多重RT-PCR方法［8］，检测方法采用韩国当地流行毒株。考虑不同地区的地域性差异，因此适宜采用国内流行毒株作为鉴别诊断。黄秋雪等［6］建立的DHAV二重RT-PCR方法，虽具有良好的特异性和敏感性，但扩增出DHAV-A（259 bp 194 bp）的特异片段大小相近，临床检测结果判定过程难以区分，容易误判。本研究建立的二重RT-PCR检测方法，NDV、NDRV、DTMUV、DPV均未扩增出条带，说明该方法具有良好的特异性；敏感性试验表明，对DHAV-1和DHAV-3检测的敏感度也较高。对临床样品的病毒鉴定结果显示，本研究建立的方法与病毒分离鉴定结果具有高度一致性。因此，本研究建立的DHAV-1和DHAV-3的二重RT-PCR方法，具有良好的特异性和较高的敏感度，可以直接用于临床样品的检测和流行病学调查，为临床上鸭肝炎的鉴别诊断和病原检测提供了快速适用的手段。

［1］苏敬良， 黄瑜， 贺荣莲， 等. 新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定［J］. 中国兽医科技， 2002， 1∶ 15-16.

［2］Tseng C H， Tsai H J. Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus［J］.Virus Res， 2007，126（1-2）∶ 19-31.

［3］Kim M C， Kwon Y K， Joh S J， et al. Recent Korean isolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a new geno-and serotype when compared to duck hepatitis virus type1 type strains［J］. Arch Virol， 2007， 152（11）∶2059-2072.

［4］陆承平. 兽医微生物学［M］. 5版. 北京∶ 中国农业出版社，2012， 460-466.

［5］何再娅， 于淼， 张玉玲， 等. 2007～2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析［J］.中国动物传染病学报， 2010， 18（1）∶ 7-15.

［6］黄秋雪， 汤承， 聂培婷， 等. 鸭甲肝病毒基因A型和C型双重RT-PCR检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报， 2012，34（2）∶ 120-123.

［7］Chen L L， Xu Q， Zhang R H， et al. Improved duplex RTPCR assay for differential diagnosis of mixed infection of duck hepatitis A virus type 1 and type 3 in ducklings［J］. Virol Methods， 2013， 192（1-2）∶ 12-17.

［8］Kim M C， Kwon Y K， Joh S J， et al. Differential diagnosis between type-specific duck hepatitis virue type1（DHV-1）and recent Korean DHV-1-like isolate using a multiplex ploymerase chain reaction［J］. Avian Pathol， 2008， 37（2）∶171-177.

DEVELOPMENT OF A DUPLEX RT-PCR ASSAY FOR DETECTION OF DUCK HEPATITIS A VIRUS SEROTYPES 1 AND 3

LI Hua-dong1，2， HUANG Xian-ming2， LU Feng-ying2， DING Mei-juan2， ZHANG Xiao-fei2
（1. College of Animal Science Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei 230061，China；2. Nanjing Tech-bank Bio-industry Co.， LTD， Nanjing 211102， China）

Two pairs of specifi c primers were designed based on the sequences of Duck hepatitis A virus （DHAV）， and single PCR assays were firstly developed for Duck hepatitis A virus serotype 1（DHAV-1） and serotype 3（DHAV-3）， respectively. After optimization of amplifi cation conditions， a duplex PCR method was then developed for differentiating DHAV-1 and DHAV-3. In the duplex PCR assay，the fragments of 751 bp for DHAV-1 and 448 bp for DHAV-3 were simultaneously amplifi ed from the mixed positive samples whereas no PCR products were amplifi ed from other virus samples， indicating its specifi city for DHAV. The sensitivity assay results showed that the lowest detection limits was 10 pg/μL for DHAV-1 and 8 pg/μL for DHAV-3. Therefore， the duplex RT-PCR assay would be used as an effective tool for diagnosis of DHAV-1 and DHAV-3.

Duck hepatitis A virus serotype 1 （DHAV-1）； DHAV-3； duplex RT-PCR

S852.659.6

A

1674-6422（2015）05-0032-04

2015-08-04

江苏省科技成果转化专项资金项目（BA2010021）

李化东，男，硕士研究生，主要从事禽病防控研究

张小飞，E-mail∶ xiaofei0804@sina.com