胡晓苗，胡顺林，陈鸿志，刘 东，戴 银，沈学怀，刘秀梵，张丹俊

（1. 扬州大学兽医学院 农业部畜禽传染病学重点开放实验室，扬州225009；2. 安徽农业科学院畜牧兽医研究所，合肥230031）

2011～2014年安徽省发病鸡群H9亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化分析

胡晓苗1，胡顺林1，陈鸿志1，刘 东1，戴 银2，沈学怀2，刘秀梵1，张丹俊2

（1. 扬州大学兽医学院 农业部畜禽传染病学重点开放实验室，扬州225009；2. 安徽农业科学院畜牧兽医研究所，合肥230031）

为了解安徽省发病鸡群H9N2亚型禽流感病毒（Avian infl uenza virus， AIV）的变异情况，本研究对2011～2014年安徽省发病鸡群的368份组织样品进行AIV的鸡胚分离和RT-PCR检测，分离鉴定到17株H9N2 AIV。对这17株进行HA基因测序及系统进化分析，结果表明：17株HA基因核苷酸序列的相似性为88.5%～99.6%，属于A/Duck/HongKong/Y280/1997病毒亚系。氨基酸比对分析显示，裂解位点326～329位氨基酸为典型的低致病性AIV特征性序列。与A/Chicken/ Shanghai/F/98疫苗株相比，17株HA蛋白受体结合位点的226位均为亮氨酸（L），呈现了人流感受体结合特性；5株200位的点突变（T→I），导致了200位潜在糖基化位点的缺失。可见安徽省分离的H9N2 AIV大部分毒株基因序列已发生变异，目前使用的疫苗能否为禽群提供足够的保护力还需要作进一步的研究。

禽流感；H9N2亚型；HA基因；遗传进化；鸡

H9N2禽流感病毒（Avian influenza virus， AIV）为低致病性禽流感病毒（lowly pathogenic Avian influenza virus，LPAIV），可引起家禽呼吸困难、腹泻、产蛋下降等症状，当继发细菌感染时可引起较高的死亡率。HA蛋白由HA基因编码，作为囊膜表面的糖蛋白，能够识别并结合宿主唾液酸的细胞受体，在病毒的感染和复制过程中发挥着重要的作用，是流感病毒主要表面抗原和保护性抗原。HA的裂解位点、糖基化位点、受体结合位点等关键性氨基酸的突变是病毒抗原性和致病性变异的分子基础之一［1-5］。自1994年我国首次报道从鸡群中分离到H9N2 AIV以来［6］，该病毒已在我国广泛分布和流行。在混合、继发感染其他疾病或不良的饲养条件下，H9N2 AIV可导致高发病率和死亡率。例如在安徽省特别是在冬季，肉仔鸡由于保温需要禽舍密闭，通风不良，AIV感染常常引起支气管栓塞而导致高发病率和死亡率。同时，AIV在广泛的疫苗选择压力之下，经过长时间的演化，容易出现一些变异群的毒株。分析H9N2 AIV的流行和抗原变异情况，了解实际生产中疾病发生的原因，可以为安徽省禽流感H9亚型的防控提供预警报告和决策依据，同时为新型疫苗的研制提供材料和方向，为筛选出候选疫苗株进行新疫苗的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疑似禽流感病料 2012～2014年采自安徽省临床疑似发生禽流感的鸡群。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂Trizol Reagent购自Invitrogen公司；RNA 酶抑制（RRI）、反转录酶及Taq DNA聚合酶等购自大连TAKARA公司；DNA回收试剂盒（DNA Gel Extraction Kit）购自Axygen 公司；新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）阳性血清、禽流感血凝素分型血清（H5、H9）由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室提供。

1.1.3 鸡胚和引物 SPF种蛋购自山东省家禽研究所SPF种鸡场，在本实验室孵化至9～11日龄备用。反转录引物为1 2碱基随机引物：5'-AGCAAAAGCAGG-3'。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离与鉴定 鸡胚分离病毒方法按照文献［7］中方法处理，临床病料样品在无菌条件下研磨，并用双抗PBS配制成10%的组织匀浆，1000×g离心5 min后，直接取上清接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔。收集的尿囊液用NDV阳性血清、AI血凝素分型血清（H5、H9）进行HI实验，确定病毒的HA亚型。对于无法用HI试验鉴定出的血凝试验阳性样品采用RT-PCR方法鉴定，具体引物和PCR条件参照文献［8］中方法进行。

1.2.2 病毒RNA的提取及反转录 用Trizol裂解法提取RNA，步骤参照Trizol试剂说明书。反转录：用含12碱基随机引物的DEPC水（稀释好的随机引物3 μL、DEPC水32 μL、共35 μL）溶解提取出来的病毒RNA，置60℃水浴10 min后冰浴5 min，加入反转录反应体系（10 μL 10×RT buffer、3 μL dNTP、1 μL反转录酶，1 μL RNA酶抑制剂，共15 μL），置42℃水浴反转录1.5 h后取出，-20℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR扩增病毒HA基因 在GenBank中查找到H9N2 AIV相应基因片段的参考核苷酸序列，采用P r i m e r v 5.0设计引物，由上海生工生物工程公司合成。H9 HA-F：5′-AGCAAAAG CAGGGG-3′，HA-R：5′-AGTAGAAACAAGG GTGTTTT-3′；H9 HA-M-F：5′-CTYCACACA GARCACAATGG-3′，H9 HA-M-R：5′-GTCACA CTTGTTGTTGTRTC -3′。参照文献［9］采用PCR分段扩增病毒基因片段，HA基因片段约1700 bp，分段扩增的片段为1200 bp和600 bp。

1.2.4 PCR产物的回收、纯化和测序 PCR 产物按DNA回收试剂盒说明书进行，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.5 基因序列拼接、比对及遗传进化分析 采用DNAStar 4.0版本中的EditSeq、MegAlign来进行序列拼接和比对；使用BLAST程序搜索出核苷酸序列和氨基酸序列的同源率，用MEGA5分析软件进行系统进化树的绘制和遗传进化分析。

2 结果

2.1 HA基因扩增结果 17个毒株HA基因开放阅读框（open reading frame， ORF）全长均为1683 bp，共编码560个氨基酸，包含18个氨基酸的信号肽部分、321个氨基酸的HA1部分和221个氨基酸的HA2部分，与H9亚型禽流感病毒华东地区经典株A/ Chicken/Shanghai/F/98相比，无任何核苷酸的插入和缺失。

2.2 HA基因核苷酸及推导的氨基酸同源性分析 17个毒株HA基因核苷酸序列的相似性为88.5%～99.6%，氨基酸序列相似性在82.0%～99.6%。17个毒株与香港地区分离到的经典毒株A/Duck/Hongkong/ Y280/97（Dk/HK/Y280/97）以及安徽省经典疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98（Ck/SH/F/98）HA基因序列的同源性结果表明，17个毒株与DK/HK/Y280/97的HA基因核苷酸及推导的氨基酸序列相似性分别在85.4%～86.5%和87.7%～88.6%，而和Ck/SH/F/98的核苷酸及氨基酸序列相似性分别为90.3%～91.3%和91.6%～93.9%。

图1 H9N2禽流感病毒HA基因遗传树Fig.1 Phylogenetic tree for HA gene of H9N2 Avian infl uenza virus

2.3 HA基因遗传进化分析 根据HA基因编码区序列绘制HA基因遗传进化树（图1）。从遗传进化树可以看出，本研究中17个分离株的HA基因基本属于Dk/HK/Y280/97-like但又与Dk/HK/Y280/97，特别是与疫苗株Ck/SH/F/98株具有一定的差异。此遗传进化分析结果与HA基因相似性分析结果是一致的，说明在2011～2014年期间，华东地区的H9N2 AIV在同源疫苗的免疫选择压下，其HA基因发生了较大的遗传漂变。

2.4 HA氨基酸变异分析 17个毒株HA裂解位点326～329位氨基酸中16株为RSSR，其中1株发生了变化，为PYSR（15株PSRSSR，1株为PSRYSR，1株为PARSSR）。其中16株均仅有2个不连续的碱性氨基酸，为典型的低致病性禽流感病毒特征性序列，与DK/Y280/97株裂解位点（PARSSR）相比324位发生A→S的变异。17个毒株中5株（CK/AH/1223/2012、CK/AH/0301/2015、CK/AH/0305/2015、CK/AH/525/2014、CK/ AH/525/2014）HA部分202位T→I的变化，导致200位糖基化位点逐渐缺失（表1）。与DK/HK/Y280/97相比较大部分毒株受体结合位点的180位发生T→A/ V变异，其余位点均高度保守（表2）。226位氨基酸与唾液酸受体NeuAc2， 6 Gal和NeuAc2， 3 Gal的结合特性有关，早期H9N2 AIV的226位氨基酸大多为Gln（Q），本研究中所有H9N2 AIV的226位氨基酸均为Leu（L）（表2），与人流感病毒的一致［10］。这表明该地区流行的H9N2 AIVs具有与NeuAc2， 6 Gal受体结合的可能，对哺乳动物（包括人）的致病可能大大增加。17株H9N2毒株的228位氨基酸均为Gly（G），与人流感病毒的Ser不同，与Ck/ SH/F/98株相同。与DK/HK/Y280/97相比，17株毒株中的绝大部分受体结合区袋状结构的左侧壁氨基酸序列发生了变异，由NGLQQR变为NGLMGR/ NGLQGR，而右侧壁的氨基酸序列保守，没有发生变异（表2）。

表1 H9N2亚型禽流感潜在糖基化位点Table 1 Potential N-glycosylation sites （PGS） of H9N2 subtype AIV isolates

表2 H9N2亚型禽流感袋状结合区和裂解位点Table2 Receptor-binding pocket and cleavage site of H9N2 subtype AIV isolates

3 讨论

3.1 分离毒株所处的分类分析 本研究对2011～2014年分离自安徽省的H9N2 AIV进行了HA基因的遗传进化分析。17个毒株与经典毒株Dk/HK/Y280/97的HA基因核苷酸及推导的氨基酸序列相比性分别在85.4%～86.5%和87.7%～88.6%，与安徽省经典疫苗株Ck/SH/F/98的HA核苷酸及氨基酸序列相比性也只有90.3%～91.3%和91.6%～93.9%。说明本研究分离的17个毒株HA基因与Ck/SH/F/98、Dk/HK/Y280/97之间的相似性并不算太高，严格说来不应划为同一亚系，但目前没有其他广为认可的新的经典株作为划分依据，只能暂时按此划分。17个分离株HA基因与疫苗株Ck/SH/F/98株进化距离较远，说明在2011～2014年期间，安徽省的H9N2 AIV虽然未发生大的遗传变异，但是与疫苗株出现一定的差异，所以目前使用的疫苗能否给禽群提供足够的保护力还需要作进一步的研究。

3.2 分离毒株HA基因变异分析 流感病毒感染细胞的先决条件为HA在感染过程中被水解成两条肽链，低致病性流感病毒HA蛋白的裂解位点含有1～2个碱性氨基酸，本研究中16个毒株该位点都是RSSR，符合低致病禽流感病毒的特征。1个毒株HA裂解位点326～329位氨基酸由RSSR变为RYSR，与DK/ Y280/97株裂解位点（PARSSR）相比324位发生A→S的变异，这些变异是否会引起病毒毒力的相关变化还有待继续监测验证。HA蛋白潜在的糖基化位点也是影响禽流感病毒致病力的重要因素，受体结合位点附近的糖基会影响病毒和宿主细胞的结合水平，裂解位点附近的糖基可能通过干扰蛋白酶进入裂解位点影响蛋白酶对HA前体蛋白的裂解。本研究中5个毒株202位T→I的变化导致200位糖基化位点逐渐缺失，该糖基化位点的缺失是否会增强病毒的毒力还有待后续研究证实。

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GENETIC EVOLUTION ANALYSIS OF HEMAGGLUTININ GENE OF H9 SUBTYPE AVIAN INFLUENZA VIRUS ISOLATED FROM DISEASED CHICKEN IN ANHUI PROVINCE FROM 2011 TO 2014

HU Xiao-miao1， HU Shun-lin1， CHEN Hong-zhi1， LIU Dong1， DAI Yin2， SHEN Xue-huai2，LIU Xiu-fan1， ZHANG Dan-jun2
（1. Key Laboratory of Animal Infectious Diseases， Ministry of Agriculture， College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， China）

A total of 368 diseased chicken samples were collected from 2011 to 2014 in Anhui Province and detected in RT-PCR for surveillance of H9N2 subtype Avian infl uenza virus （AIV）. As a results， 17 samples purifi ed in chicken embryonic eggs were positive for H9N2 subtype AIV and their HA genes were sequenced. The sequence alignment showed that the homology of these HA genes were from 88.5% to 99.6%， belonging to the A/Duck/HongKong/Y280/1997 phylogenetical lineage. The HA cleavage site（326～329aa） of these isolates belonged to the low pathogenicity. As compared with A/Chicken/ Shanghai/F/98 vaccine strain， aa226 （T→I） in all 17 isolates，which was a characteristic of human infl uenza virus-like receptor specifi city. A single amino acid mutation （T→I） resulted in the deletionof potential glycosylation sites at position 200. These results indicated that most H9N2 subtype AIV isolates from the diseased chicken fl ocks in Anhui Province had experienced genetic variation. Further study is needed to determine whether the currently used vaccines can provide effective protection for chickens.

Avian infl uenza； H9N2 subtype； HA gene； genetic evolution； chicken

S852.659.5

A

1674-6422（2015）05-0021-06

2015-05-05

国家现代农业产业技术体系项目（CARS-41）；安徽省农科院科技创新团队项目（11C0404）；国家自然科学基金项目（31302044）

胡晓苗，男，硕士，助理研究员，主要从事兽医微生物与免疫学研究

刘秀梵， E-mail：xfliu@yzu.edu.cn；张丹俊， E-mail：zhangdj694@sina.com