朱文奇，胡序明，陈世豪，刘洋洋，孙 振，耿拓宇，宋成义，高 波，王宵燕，秦爱建，崔恒宓

（1. 扬州大学 表观遗传学及表观基因组学研究所，扬州225009；2. 扬州大学 教育部禽类预防医学重点实验室，扬州225009；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传学分析方法的建立及应用

朱文奇1，胡序明1，陈世豪1，刘洋洋1，孙 振1，耿拓宇1，宋成义1，高 波1，王宵燕1，秦爱建2，3，崔恒宓1

（1. 扬州大学 表观遗传学及表观基因组学研究所，扬州225009；2. 扬州大学 教育部禽类预防医学重点实验室，扬州225009；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

根据NCBI公布的禽内源性反转录病毒ALVE1序列设计引物，以SPF鸡胚制备的成纤维细胞为生物材料，建立了ALVE基因序列分析、甲基化水平和转录表达检测方法。以鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast cell，CEF）和巨噬细胞系（HD11）两种细胞的基因组为模板，通过常规PCR扩增获得了1912 bp的扩增产物，测序后与内源性ALVE1序列比对，核苷酸同源性高达98%以上，说明扩增产物为内源性病毒序列。同时，利用焦磷酸测序分析LTR片段甲基化水平，结果显示，LTR在非免疫细胞CEF中的甲基化水平显著高于巨噬细胞系HD11。利用常规RT-PCR和荧光定量PCR在两种细胞均检测到禽内源性反转录病毒LTR基因、gag基因、pol基因和env基因的转录表达。本研究为今后分析禽内源性反转录病毒ALVE功能提供了方法，同时也为深入研究禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传学调控机制奠定了基础。

禽内源性反转录病毒；DNA甲基化；表观遗传学

内源性反转录病毒（Endogenous retroviruses）是基因组成分，以其“前病毒”形式存在于宿主基因组中，大部分不表达，功能很大程度上未知，几乎在所有哺乳动物（如人、鼠、猫和羊）和脊椎动物（如鸡）基因组中都存在。近年来，关于禽内源性反转录病毒的研究主要集中在序列鉴定、分析及其在染色体上的分布［1-3］。人们在鸡基因组上已鉴定出多种鸡内源性反转录病毒［4，5］，如E亚群禽白血病病毒（subgroup E avian leukosis viruses，ALVE）或称ev位点（ev loci）和内源性禽反转录病毒（Endogenous avian retrovirus，EAV）（如EAV-0、EAV-51和EAV-HP）。其中，对ALVE的关注和研究最多。

研究表明，ALVE有可能与宿主遗传抗性和免疫应答有关。然而，其潜在的功能及机制仍不清楚。表观遗传学是与DNA序列无关但能调节基因表达、影响表型的一种遗传现象。DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，在调节基因表达和维持细胞功能中起着十分关键的作用。研究发现，与ALV抗性品系鸡line 72（含有ALVE1和2基因）相比，内源性ALVE基因在ALV易感品系鸡line 63（含有ALVE1和ALVE3基因）中的甲基化水平偏低［6］，这暗示禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传规律可能与鸡的遗传抗性有关。

本研究以SPF鸡胚制备的成纤维细胞为生物材料，建立了ALVE基因序列分析、甲基化水平和转录表达检测方法。同时，我们发现ALVE在两种细胞中的表观遗传信息存在明显差异。研究结果为今后分析禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传规律提供了方法，同时也为深入研究禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传学调控机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 细胞 SPF白羽种鸡蛋由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供，孵化至10日龄后，按常规方法制备鸡胚成纤维细胞（chick embryo fibroblast， CEF）。禽巨噬细胞系（HD11）由扬州大学焦新安教授馈赠。

1.2 主要试剂 Axygen总RNA小量制备试剂盒购自美国Axygen公司；反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 和荧光染料试剂SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自日本TaKaRa公司；全基因组提取试剂盒QIAGEN Blood& Tissue Kit 、全基因DNA重亚硫酸盐处理试剂盒EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit、焦磷酸测序分析DNA甲基化试剂盒（PyroMark Q24 Advanced CpG Kit、 PyroMark Denaturation Sol、PyroMark Wash Buffer和PyroMark®PCR Kit）购自德国QIGEN公司；1640培养基、DMEM和胎牛血清购自GIBCO公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计与合成 根据NCBI公布的禽内源性反转录病毒ALVE1序列（登录号：AY013303.1），依次设计了1对PCR扩增引物用于检测env基因序列，1对焦磷酸测序引物用于分析LTR片段甲基化水平，5对常规RT-PCR引物和5对Real-time PCR引物用于检测LTR片段、gag、pol和env基因转录表达水平。引物委托Invitrogen公司合成，序列见表1。

1.4 基因组DNA提取和PCR扩增 分别将CEF和HD11细胞接种在6孔细胞培养板里，24 h后收集细胞。按照全基因组提取试剂盒说明书分别提取基因组DNA，测定浓度后分两份保存，一份用于检测env基因序列，一份用于DNA甲基化分析。按常规方法进行PCR扩增，env引物序列参见文献［7］。PCR扩增体系：cDNA 模板1 μL、5×SF Buffer 4 μL、DNTP mix 0.4 μL、PhantaTMSuper-Fidelity DNA Polymerase 0.4 μL、上下游引物各1μL、超纯水12.2μL。反应条件：95℃预变性3 min，35个循环（95℃变性10 s ，68℃退火30 s，72℃延伸2 min），72℃延伸10 min。最后，用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.5 焦磷酸测序引物设计 首先根据ALVE1 LTR基因序列设计PCR引物和焦磷酸测序引物用于检测CpG甲基化位点，引物序列见表1。然后，使用PyroMark Q24 Advanced Software 设计测序目的序列。测序目的序列：ACGCAAGGACATATGGGCGTAG ACGAAGCTATGCACGATTATATAAGCTGTTGCC ACCATCAAATAAACGCCATTTTACCATTCACCA CATTGG；重亚硫酸盐转化序列：AYGTAAGGAT ATATGGGYGTAGAYGAAGTTATGTAYGATTATA TAAGTTGTTGTTATTATTAAATAAAYGTTATTTT ATTATTTATTATATTGG在测序的靶向序列中添加一个C（红色标记），以检测该位置的胞嘧啶是否完全转化。如图1所示。

1.6 焦磷酸测序分析LTR甲基化水平 DNA模板经PyroMark PCR Kit重亚硫酸盐处理后，在PCR热循环仪中扩增目的片段。反应体系：LTR上游引物（10 μmol/mL）1 μL、LTR下游引物（10 μmol/ mL）1 μL、重亚硫酸盐处理后DNA（约 500 ng）2 μL、PyroMark PCR Master Mix 12.5 μL、CoralLoad Concentrate 2.5 μL、灭菌ddH2O 6 μL。反应条件：95℃预变性15 min，45个循环（94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30s），72℃延伸10 min。最后，利用琼脂糖凝胶电泳进行验证并将条带大小正确的PCR产物上机测序。

表1 本文所使用的引物Table 1 Primers used in this study

图1 PyroMark Q24 Advanced Software自动生成的碱基图谱Fig. 1 Base map automatically generated by PyroMark Q24 Advanced Software

1.7 总RNA提取和反转录 分别将CEF和HD11细胞接种在6孔细胞培养板里，24 h后收集细胞并按照Axygen总RNA小量制备试剂盒说明书操作步骤提取总RNA，然后用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser将1 μg总RNA反转录成cDNA产物。产物于-70℃保存，用于常规RT-PCR和Realtime PCR分析。

1.8 常规RT-PCR和RT-qPCR 将CEF和HD11细胞cDNA产物稀释后分别用于常规RT-PCR和Realtime PCR。常规RT-PCR反应体系：cDNA 模板1 μL、Taq酶（Mix）10 μL、上下游引物各1 μL、灭菌ddH2O 7 μL。反应条件：94℃预变性5 min，30个循环（94℃变性30 s ，58℃退火30 s，72℃延伸30s），72℃ 10 min。Real-time PCR反应体系：cDNA 模板1 μL、ROX II 0.4 μL SYBR Green II 10 μL、上下游引物各2 μL、灭菌ddH2O 4.6 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，40个循环。

2 结果

2.1 禽内源性反转录病毒ALVE基因env序列扩增 首先以CEF和HD11全基因组DNA为模板进行PCR扩增env基因，琼脂糖凝胶电泳结果表明，成功地扩增出相应产物（图2），产物片段大小为1912 bp，测序后与内源性ALVE1序列比对，核苷酸同源性高达98%以上，说明扩增产物为内源性病毒序列（测序数据未公开）。与已发表的ALVE1基因env序列比对结果显示：在CEF和HD11两种细胞基因组中，禽内源性反转录病毒env序列不完全一致，多个位点呈现单核苷酸多态性。

图2 ALVE env基因PCR扩增产物电泳图Fig.2 PCR-amplifi ed products of env gene from ALVE M： DNA分子量标准（DL2000）； 1： CEF细胞基因组DNA； 2： HD11细胞基因组DNA

2.2 禽内源性反转录病毒ALVE基因DNA甲基化水平分析 LTR基因是长末端重复序列，位于ALVE1序列的两端，控制病毒序列的启动子、增强子和多腺苷酸化信号区域，所以选择检测两种细胞的LTR基因的甲基化水平。用于DNA甲基化分析的扩增引物可扩增出145 bp产物（图3）。CEF细胞基因组和HD11细胞基因组LTR甲基化图谱结果分别如图4A和图4B所示。两种细胞基因组LTR 4个CpG位点呈高度甲基化状态并存在显著差异，其中CEF细胞基因组LTR甲基化程度要高于HD11细胞。

图3 ALVE LTR基因PCR扩增产物电泳图Fig.3 PCR-amplifi ed products of LTR gene from ALVE

2.3 禽内源性反转录病毒ALVE基因转录表达水平分析 利用常规RT-PCR和Real-time PCR分别检测了禽内源性反转录病毒ALVE在两种细胞中的转录表达。常规RT-PCR结果如图5A所示，在CFE和HD11细胞中均能检测到禽内源性反转录病毒ALVE LTR、gag、pol和env（GP85和GP37）基因的转录表达，其中LTR在CEF细胞中的转录水平明显高于HD11细胞。通过Real-time PCR进一步分析ALVE在两种细胞中的相对表达含量发现，LTR转录表达水平在CEF细胞中比其在HD11细胞中的转录表达水平高61.9倍，而gp85和gp37在HD11细胞中的转录表达比在CEF细胞中分别高256.6和3.8倍（见图5）。

3 讨论

本研究通过DNA甲基化分析发现，与非免疫细胞CEF相比，LTR甲基化水平在巨噬细胞系HD11中偏低。定量PCR分析发现，LTR在巨噬细胞系HD11中的转录表达水平显著低于非免疫细胞CEF，而gp85和gp37则显著高于非免疫细胞CEF。这一现象与LTR自身的转录表达并非一致，而是与gp85和gp37的转录表达一致，即LTR高甲基化伴随gp85和gp37低转录水平表达（CEF细胞），而LTR低甲基化伴随gp85和gp37高转录水平表达（HD11细胞）。这些结果说明禽内源性反转录病毒ALVE LTR甲基化水平可能与gp85和gp37转录表达有关。

禽内源性反转录病毒ALVE可能在外源性ALV病毒感染过程中发挥着一定作用［8，9］。研究发现，缺乏ALVE基因的品系鸡ADOL line 0尽管对内源性ALVE具有抗性（由于缺乏ALVE受体），但是对外源性ALVA、B、C和J均易感。与原代CEF（含有内源性ALVE基因）相比，鸡胚成纤维细胞系DF-1（无内源性ALVE基因）对ALV感染敏感，并且ALV-A、ALV-B 和 ALV-J均能诱导DF-1形成细胞病变而原代CEF无明显细胞病变形成［10］。此外，禽内源性反转录病毒在B15I5品系鸡（含有ALVE1、ALVE6和ALVE10）中的存在可能降低了宿主对ALV-J的免疫（与line 0品系鸡相比）［11］。胚胎时期感染内源性ALV（RAV0）提高鸡对外源性ALV的易感性即减弱鸡对外源性ALV的抵抗力［12］。与ALV抗性品系鸡line 72（含有ALVE1和2基因）相比，内源性ALVE基因在ALV易感品系鸡line 63（含有ALVE1和ALVE3基因）中的甲基化水平偏低［6］。基于这些研究，可以看出禽内源性反转录病毒ALVE很有可能与遗传抗性有关联。

假设ALVE与遗传抗性有关，那么具有ALVE基因的品系鸡呈现出不同的遗传抗性能力，表明其可能与内源性反转录病毒ALVE的表观遗传有关。本研究建立了ALVE表观遗传学分析方法，为今后深入研究禽内源性反转录病毒ALVE的功能及其表观遗传学调控机制奠定了基础。

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DEVELOPMENT AND APPLICATION OF ANALYTICAL METHODS FOR THE EPIGENETIC ALTERATIONS OF AVIAN ENDOGENOUS RETROVIRUS ALVE

ZHU Wen-qi1， HU Xu-ming1， CHEN Shi-hao1， LIU Yang-yang1， SUN Zhen1， GENG Tuo-yu1，SONG Cheng-yi1， GAO Bo1， WANG Xiao-yan1， QIN Ai-jian2，3， CUI Heng-mi1
（1. Institute of Epigenetics and Epigenomics， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 2.Ministry of Education Key Lab for Avian Preventive Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009， China）

In the present study， methods for analysis of genomic sequence， evaluation of DNA methylation and expression level of Avian endogenous retroviruses ALVE1 were established using chicken embryo fi broblast （CEF） cells and published NCBI information. A product of 1912 bp was amplifi ed from CEF and avian macrophage （HD11） genomes using conventional PCR. The results showed that their sequences shared at least 98% homology to Avian endogenous retroviruses ALVE1， indicating that the amplifi cation product was endogenous viral sequences. In addition， the expression of endogenous viral LTR， gag， pol and env genes were detected in CEF and HD11 cells using conventional RT-PCR and RT-qPCR. Methylation levels of LTR gene in CEF cells were signifi cantly higher than those in HD11. The establishment of methods for analyzing the epigenetic pattern of Avian endogenous retrovirus ALVE would benefi t to further research of its regulatory mechanisms.

Avian endogenous retroviruses； methylation； epigenetics

S852.659.3

A

1674-6422（2015）05-0015-06

2015-07-15

国家973项目（2012CB517605）；国家自然科学基金项目（81171965，81372237、91540117）；江苏省畜牧学优势学科项目；中国博士后科学基金第57批面上资助项目（2015M571828）

朱文奇，男，硕士研究生，动物营养专业；胡序明，男，博士，主要从事内源性反转录病毒功能及其表观遗传学机制研究

崔恒宓，E-mail：hmcui@yzu.edu.cn；秦爱建，E-mail：aijian@yzu.edu.cn