高 飞，曲泽慧，姜一峰，李丽薇，虞凌雪，周艳君，杨 莘，夏天奇，郑海红，童光志

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

·研究论文·

重组猪瘟病毒C株E2蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建及鉴定

高 飞1，2，曲泽慧1，姜一峰1，2，李丽薇1，虞凌雪1，周艳君1，杨 莘1，夏天奇1，郑海红1，童光志1，2

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

本研究在猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）弱毒株（HuN4-F112）感染性克隆的基础上，在其基因组ORF1b和ORF2之间插入（classical swine fever，CSF）疫苗毒C株的E2基因，并在E2基因3'端下游插入PRRSV的转录调控序列6（transcription regulatory sequence 6，TRS6），构建成重组全长感染性克隆（pA-C-E2）。用Swa I线性化该质粒，并体外转录后，将RNA转染MARC-145细胞并传代1次，即可拯救出重组病毒vA-C-E2，在至少20代的传代过程中能够保持遗传稳定性。重组病毒与亲本病毒vHuN4-F112在病毒滴度、空斑形态、蛋白表达等方面没有明显差异；多步生长曲线结果显示，该重组病毒与亲本毒具有相似的生长特性。间接免疫荧光（indirect immunofl uorescence，IFA ）结果显示，重组病毒不仅能够表达PRRSV N蛋白，也可以表达猪瘟病毒E2蛋白。本研究结果为研制CSF和PRRS新型基因重组疫苗奠定了坚实物质基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪瘟病毒；重组病毒；E2蛋白

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，同属的成员还包括马动脉炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）、猴出血热病毒（Simian hemorrhagic fever virus，SHFV）、鼠乳酸脱氢酶升高症病毒（Lactate dehydrogenase elevating virus，LDV）［1，2］。PRRSV给全世界养猪业造成了巨大的经济损失［2］。中国自2006年爆发高致病性猪繁殖与呼吸综合征（highlypathogenic PRRS， HP-PRRS）之后［3-5］，该病一直在我国猪场中肆虐，区域性的爆发时有发生。PRRSV基因组为单股正链RNA，5'端有5'非翻译区（5' UTR）和5'帽结构，3'端有3'非翻译区（3' UTR）和3' poly（A）尾，编码至少10个读码框（open reading frames，ORFs）［1，6］。与其他套式病毒目成员一样，PRRSV也采用非连续性转录的方式转录出一系列具有5'和3'共末端的亚基因组mRNA（subgenomic mRNA，sg mRNA），用以翻译结构蛋白GP2a、2b、3、4、5a、5、M和N。在这个过程中发挥重要调控作用的顺式作用元件为病毒的转录调控序列（transcription regulatory sequence，TRS），通过位于5'UTR中的Leader TRS和下游基因编码区中的Body TRS的互补配对，发挥其调控作用［6］。由于PRRSV中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）的自我纠错能力差以及RNA重组的频繁发生，PRRSV具有易突变的特性［1］。目前，利用反向遗传操作系统研究PRRSV病毒分子病毒学，尤其是病毒变异以及致病性对于能够有效防控PRRS变得越来越迫切。另一方面，基于反向遗传操作技术，PRRSV基因组也可以被用作外源基因表达的载体。病毒基因组ORF7、Nsp2、ORF1b和ORF2的基因间区，ORF7和3'UTR的基因间区都曾被用作外源基因插入的位点。插入的基因包括流感的血凝素抗原（hemagglutinin，HA）、绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）、PCV2的衣壳蛋白（Capsid）［7-11］。然而，单纯融合外源基因构建的重组病毒通常并不具备遗传稳定性，在连续的细胞传代过程中会丢失一部分外源基因的编码序列或者发生碱基突变。但是如果将外源基因置于TRS控制下，使其作为一个新的亚基因组进行转录及之后的表达，由此构建的突变病毒则具有遗传稳定性［8，10］。PRRSV基因组具有很多重叠的基因编码区，这些重叠区对于外源基因的插入表达造成一定的困难。有研究通过反向遗传操作将重叠区拉开，但所获得的病毒在病毒滴度、空斑形态等病毒学特性上与亲本毒有差异［12］。因此，插入位点的选择至关重要。在2型PRRSV基因组中，ORF1b/ORF2、ORF4/ORF5这两个位点的相邻基因编码区是有间隔的，成为外源基因插入的较好选择［8，12］。

猪瘟（classical swine fever，CSF）也是临床上严重威胁养猪业的一种严重的接触性传染病，造成的经济损失巨大。其病原猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的囊膜糖蛋白E2（gp55）是一种重要的保护性抗原，具有高度的免疫原性，可以诱导机体产生高水平的中和抗体［13］。目前已被批准生产的猪瘟标记疫苗是Advasure（Pfizer，UK）和Porcilis Pesti（ntervet，the Netherlands），二者均是以猪瘟病毒E2蛋白为基础研发的亚单位疫苗。临床上，PRRSV和CSFV两种疫苗均被广泛应用于猪场免疫中，但是由于二者免疫反应的相互干扰，很难获得较好的免疫效果。因此，通过反向遗传操作技术，研发一种新型基因工程重组疫苗，使其能够同时对两种病原产生免疫反应变得至关重要。

基于以上研究背景，在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞致弱疫苗株vHuN4-F112［5，14］感染性克隆基础上，插入CSFV疫苗株C株的E2蛋白基因，获得能够稳定表达猪瘟C株E2蛋白的重组PRRSV，对其进行一系列病毒学特性分析及遗传稳定性检测，并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分析，初步评估其作为疫苗候选株的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与病毒 非洲绿猴肾细胞（MARC-145）由中国农业科学院上海兽医研究所猪病实验室（以下简称本实验室）保存；高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（GenBank登录号：EF635006）的细胞传代致弱株vHuN4-F112［5，14］在本实验室中作为亲本病毒对照与嵌合突变病毒作比较；文中所用到的猪瘟病毒C株来源于猪瘟弱毒疫苗株［13］（GenBank登录号：AF091507）。

1.1.2 试剂 限制性内切酶购自NEB和TaKaRa公司；TOP10感受态细胞购自TIANGEN公司；化学转染试剂DMRIE-C试剂购自Invitrogen公司；突变PCR用聚合酶为pfu II DNA Polymerase购自Strategene公司；OPTI-MEM购自Invitrogen公司；RT-PCR反转录酶为AMV购自TaKaRa公司；PRRSV的N蛋白的单抗由本实验室保存；CSFV E2蛋白的单抗由中国兽医药品监察所王琴研究员惠赠；荧光二抗Alexa Fluor 488/568-labeled goat anti-mouse IgG（H+L）购自Invitrogen公司。

1.1.3 主要仪器 超净工作台为上海三超净化设备有限公司产品；DNA Thermal Cycler480 PCR仪为美国PERKIN ELMER公司产品；恒温培养摇床（型号THZ-C）为江苏太仓实验设备厂产品；恒温培养箱为上海医疗器械七厂产品；水平电泳仪（型号DY-a）为上海康达电子仪器厂产品；荧光倒置显微镜为Olympas公司产品；离心机（型号5415D）为Eppendorf公司产品。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒构建 高致病性PRRSV细胞传代致弱株感染性克隆pHuN4-F112由中国农业科学院上海兽医研究所猪病室构建和保存。通过SOE PCR的方法获得重组猪瘟病毒C株的E2蛋白基因的PRRSV突变片段，其中一个模板为从猪瘟疫苗毒中抽提的病毒RNA。回收以后用Asc I 和EcoR V双酶切，酶切回收产物通过T4连接酶连接至经同样双酶切的pHuN4-F112，由此构建全长突变克隆pA-C-E2。用Asc I和EcoR V对 pA-C-E2进行双酶切鉴定，检验其在ORF1b和ORF2之间是否成功插入猪瘟病毒C株的E2蛋白基因。本文中所用到的引物见表1，构建方法示意图见图1。

1.2.2 病毒拯救及纯化传代 待六孔板的MARC-145细胞长到密度大约80%时，用DMRIE-C转染试剂（Ambion，Austin，TX）以等量（2 μg）pA-C-E2和pHuN4-F112的体外转录RNA转染MARC-145细胞［14］，在5%CO2、37℃温箱中培养，转染72 h后，收集上清，作为初次拯救的第一代病毒，命名为vAC-E2，标记为P1并接种于MARC-145细胞，每天观察细胞病变（cytopathic effect，CPE）。当出现80%的病变时，收集上清并保存于-80℃，作为第二代病毒，标记为P2。P2代病毒液稀释1000倍后，接种于新鲜的MARC-145细胞，感染后72 h收集病毒上清，标记为P3，以相同的方式收集P2～P5代病毒（稀释传代）［15，16］。从第6代病毒（P6）开始，每代进行空斑纯化传代，一直传代至第20代（P20）。具体操作步骤见参考文献［7］。

1.2.3 传代病毒突变位点的鉴定 将感染MARC-145细胞的病毒上清用QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAgen，Hilden，Germany）提取病毒RNA，参考说明书进行操作。以提取好的RNA为模板，使用Thermo公司的反转录试剂盒进行RNA反转录，得到相应的cDNA，利用该模板及相应的引物（HF11805与HR12100见表1）得到突变位点所在的PCR片段，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定及纯化后，送Invitrogen公司进行测序，测序结果用DNAStar软件与HuN4-F112基因进行比对分析。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 间接免疫荧光（indirect immunofluorescence analysis，IFA） 将P20代的病毒感染MARC-145细胞48 h后，弃去维持液培养基。冰甲醇固定10 min，1% BSA室温封闭30 min，用1∶600倍比稀释的PRRSV N蛋白的特异性单抗（SR30A，Rural Technology，LTD）或1∶1000倍比稀释的CSFV E2蛋白的特异性单抗，37℃孵育2 h，再分别加入Alexa Fluor 488/568 -labeled羊抗鼠的荧光二抗（1∶800倍比稀释），37℃孵育1 h，PBS洗5遍后［15，16］，用1 μ g/mL的4'，6'-diamidino-2-phenylindole （DAPI）对细胞核进行染色，孵育5 min。用PBS对细胞单层进行最后3次洗涤，在倒置荧光显微镜下观察结果，并拍照。

1.2.5 嵌合病毒遗传稳定性 将P5、P10、P15、P20代的vA-C-E2病毒培养上清抽提RNA，反转录后扩增突变区域并测序，鉴定外源基因的完整性及周边序列有无突变位点的引入［15，16］，并对以上4个代次的vA-C-E2进行N蛋白和猪瘟E2蛋白间接免疫荧光鉴定用以重组猪瘟C株E2蛋白的PRRSV的遗传稳定性鉴定。

1.2.6 拯救病毒vA-C-E2的生物学特性分析

1.2.6.1 空斑形态学分析 将本研究中所有的第六代（P6）拯救病毒用DMEM系列稀释后，用300 μL感染六孔板中的MARC-145细胞，37℃孵育1 h后，弃掉病毒液，加入等比例的2%低熔点琼脂糖与2×MEM，再加入4%FBS（终浓度为含2%FBS的MEM，含1%的琼脂糖），5 mL/孔铺到6孔细胞板中。室温凝固后，于37℃培养箱倒置培养4～5 d，待出现空斑后，在孔中加入2 mL 4%的甲醛溶液固定1 h，甩掉凝胶，用5%结晶紫溶液（溶于20%乙醇溶液）染色［7，12，15，16］。

1.2.6.2 多步生长曲线的绘制 将300 μL系列传代的P20代病毒上清（0.01MOI）接种于MARC-145细胞，37℃孵育1 h后，弃掉病毒液，每孔补充3 mL含有2% FBS的MEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中，并在不同时间点（6、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h）收集200 μL细胞上清，同时补充200 μL新的含2% FBS的MEM培养基。测定每个时间点的病毒滴度并以TCID50表示［17］，用GraphPad软件绘出病毒的多步生长曲线［7，15，16］。

2 结果

2.1 表达猪瘟C株E2蛋白的PRRSV全长感染性克隆的构建与MARC-145细胞感染性检测 基于北美型（type 2） 全长感染性克隆pHuN4-F112，在其ORF1b的终止密码子和ORF2的起始密码子之间通过SOEPCR的方法插入猪瘟C株E2蛋白基因和TRS6。具体构建方法如图1，将构建好的感染性克隆pA-C-E2进行EcoR V和Asc I双酶切，可以看出pA-C-E2出现大小约为1363 bp的条带，说明猪瘟病毒C株E2蛋白基因成功插入，结果见图2。将重组突变体克隆pA-C-E2及亲本全长克隆pHuN4-F112进行线性化体外转录，将体外转录的RNA转染MARC-145细胞并传代，二者成功拯救出病毒并依次命名为vA-C-E2和vHuN4-F112，因此，说明pA-C-E2和pHuN4-F112在MARC-145细胞上拯救出相应病毒vA-C-E2和vHuN4-F112（图3）。

图1 重组突变全长克隆pA-C-E2的构建示意图Fig.1 Schematic for construction of recombinant full-length cDNA clone pA-C-E2

图2 重组突变全长克隆pA-C-E2的EcoR V和Asc I 双酶切鉴定图谱Fig.2 Electrophoresis identifi cation of recombinant full-length cDNA clone pA-C-E2 with EcoR V and Asc I digestion

图3 重组突变全长pA-C-E2和亲本pHuN4-F112的拯救Fig.3 The infectious identifi cation for the mutant pA-C-E2 and the pHuN4-F112

2.2 重组突变病毒与亲本病毒N蛋白表达水平的比较 将等量（0.01 MOI）的重组病毒vA-C-E2与亲本毒vHuN4-F112感染MARC-145细胞后，收上清，并接种于新鲜MARC-145，由2.1中所得的结果得知，接种第60～72 h病毒量达到峰值。取接种病毒第60 h细胞上清进行间接免疫荧光检测PRRSV核衣壳蛋白（N）和CSFV囊膜糖蛋白E2的表达。由图4可见，重组突变病毒vA-C-E2转染孔中与亲本毒vHuN4-F112转染孔中均检测大范围抗N蛋白的特异性荧光，并且荧光水平相当，说明重组病毒vAC-E2和亲本病毒vHuN4-F112具有相似的复制能力。另外，在CSFV E2蛋白的检测中，发现重组突变病毒vA-C-E2感染孔中出现了大量的针对猪瘟E2蛋白的特异性荧光。而亲本毒和空白对照孔中无任何荧光信号，说明vA-C-E2能够表达猪瘟E2蛋白。对P5、P10、P15、P20代的vA-C-E2进行了相同的IFA检测，发现随着传代次数的增加，vA-C-E2表达E2蛋白的水平并无明显差异，由此说明在蛋白表达层面上重组突变病毒具有遗传稳定性（图略）。2.3 重组突变病毒的遗传稳定性分析 选取P5、P10、P15、P20的突变病毒vA-C-E2进行基因组RNA的抽提，反转录后扩增突变区域，克隆测序以检测插入的猪瘟C株E2蛋白基因的遗传稳定性。图5结果显示，vA-C-E2至少可以在连续20次的传代过程中保持遗传稳定。

图4 免疫荧光分析vA-C-E2重组突变病毒感染MARC-145细胞后的蛋白表达Fig.4 IFA for structural protein expression in MARC-145 cells infected with vA-C-E2

图5 重组突变病毒的遗传稳定性分析Fig.5 Genetic stability analysis for vA-C-E2

2.4 重组病毒与亲本毒在病毒生物学特性水平的比较对突变病毒vA-C-E2和亲本病毒vHuN4-F112（选取P20病毒）进行空斑形态学比较（图6），结果表明突变病毒在空斑形态、数目上均与亲本病毒无显著差异多步生长曲线结果（图7）显示，vA-C-E2和vHuN4-F112也无明显差异，证明了重组突变病毒与亲本病毒在病毒学特性水平差异不显著。vHuN4-F112在病毒学特性方面无显著差异，并且同时可以表达PRRSV的N蛋白和CSFV的E2蛋白，可以作为一种能够同时为PRRSV和CSFV感染提供保护的疫苗候选株，能够突破临床上两个病毒疫苗同时使用所造成的相互影响，减少免疫次数，达到一针防两病的效果。

图6 突变病毒与亲本病毒的空斑形态学比较Fig.6 Plaque morphology comparison for the mutant virus and parental virus

图7 重组突变病毒与亲本病毒的多步生长曲线Fig.7 The multi-step growth curves of the mutant virus and the parental virus

3 讨论

通过反向遗传操作技术，在PRRSV感染性克隆的基础上，插入外源基因，使PRRSV基因组成为外源基因表达的载体，目前已有不少报道和研究［7-11］。本研究通过SOE PCR的方法，获得融合猪瘟C株E2蛋白基因的突变片段，并在外源基因3端下游插入此病毒的TRS6，然后利用HuN4-F112基因组上的两个单酶切位点Asc I和EcoR V，通过双酶切突变片段替换全长感染性克隆pHuN4-F112上的相应片段，构建了PRRSV重组猪瘟C株E2蛋白的突变全长克隆pAC-E2，经过MARC-145细胞的转染与传代之后，发现pA-C-E2可以拯救出活病毒vA-C-E2，此病毒在病毒滴度、空斑形态等与亲本病毒vHuN4-F112无显著差异，并且能够稳定表达猪瘟E2蛋白。对其遗传稳定性分析发现，该病毒能够在至少20代的连续细胞传代过程中保持遗传稳定，插入的E2蛋白基因未发生缺失或插入突变，也未被检测到有碱基突变的引入。这种构建的方法较之前的研究［8，10］免去了外源酶切位点的插入，降低了与亲本病毒的差异，减少了外源基因的引入，从而提高了病毒的稳定性。PRRSV基因组是高度浓缩的RNA，许多临近的ORF之间有重叠区，而ORF1b与ORF2之间存在1 bp的间隔（A），不存在重叠基因，更有利于外源基因的插入［8，12］。另外使外源基因作为一个新的亚基因组mRNA进行转录和表达［8，10］，能够最大程度上维持外源基因的遗传稳定性。本研究中所获得的表达猪瘟病毒C株E2蛋白的重组病毒vA-C-E2与亲本疫苗毒

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CONSTRUCTION AND ANALYSIS OF RECOMBINANT PORCINE
REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS EXPRESSING E2
PROTEIN OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS C STRAIN

GAO Fei1，2， QU Ze-hui1， JIANG Yi-feng1，2， LI Li-wei1， YU Ling-xue1， ZHOU Yan-jun1，YANG Shen1，XIA Tian-qi1， ZHENG Hai-hong1， TONG Guang-zhi1，2
（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009， China）

Based on type 2 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） full-length infectious cDNA clone pHuN4-F112， using SOE PCR， the E2 gene of Classical swine fever virus （CSFV） C strain was inserted between ORF1b and ORF2. An extra transcription regulatory sequence 6 （TRS6） was inserted behind the exogenous gene in order to make E2 gene expression as an unique sg mRNA expression， then the recombinant pA-C-E2 were constructed. After Swa I linearization， in vitro transcription， synthetic RNA was transfected into MARC-145 cells， and viable virus vA-C-E2 could be rescued. vA-C-E2 was conducted for genetic stabilityidentifi cation， and the result showed that recombinant virus could maintain genetically stable in at least 20 times cell passage processes. Indistinguishable virologic characteristics of vA-C-E2 were verifi ed compared with the parental virus vHuN4-F112 in viral propagation，plaque morphology， protein expression. Multi-step growth curve showed that the peak titer and the propagation tendency were similar. The results of IFA shown that recombinant virus could not only produce PRRSV N protein， but also the E2 protein of CSFV. The recombinant vA-C-E2 would become an important tool for further PRRSV research and the bivalence vaccine innovation and development afterwards.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus； Classical swine fever virus； recombinant virus； E2 protein

S852.659.6

A

1674-6422（2015）05-0001-09

2015-07-15

国家自然科学基金（31300140、31302098）；973计划项目（2014CB542701）；863计划（2011AA10A208-2）欧盟Horizon 2020项目SAPHIR（633184）；国家科技支撑计划项目（2015BAD121301-1）

高飞，女，博士，助理研究员，主要从事PRRSV分子病毒学分析

童光志，E-mail：gztong@shariac.cn