张翠彩，徐建民，李秀文，曹志强，蒋秀高

2.江西省疾病预防控制中心，南昌 330029

钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的一种人兽共患病。钩端螺旋体的传统分类方法依赖于血清学分类，其采用暗视野显微凝集试验（The microscopic agglutination test，MAT）确定血清群，进一步采用凝集交叉吸收试验（Cross Agglutinin Absorption Test，CAAT）确定血清型。钩端螺旋体的血清型别极其复杂，目前世界上流行的主要致病性钩端螺旋体可多达300多个血清型，隶属于至少25个血清群。开展传统的血清学分类方法，需要提前准备一系列的标准菌株或者标准血清，该试验方法操作繁琐，费时费力，只有在有条件的参考实验室方可开展，因此，对于钩端螺旋体的分型分析在基层实验室受到很大的限制。随着分子生物学技术的快速发展，多位点序列分析（Multilocus sequence typing，MLST）逐渐被应用于病原体分子流行病学研究，该方法简便快捷，不需要培养大量活菌，只需少量的DNA即可，结果数字化可进行不同实验室间的对比分析。目前，MLST可较好的应用于钩端螺旋体基因分型、流行病学溯源、种群结构、亲缘进化关系分析等研究［1］。近年来，黄疸出血群是中国钩端螺旋体病的主要致病性血清群［2］。本研究选取近年来我国四川、江西、湖南三个省份39株致病性黄疸出血群钩端螺旋体菌株，采用MLST方法进行基因分型分析，初步探讨我国致病性钩端螺旋体的分子流行病学、种群结构、亲缘进化关系等特征。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 本研究共选用黄疸出血群致病性钩端螺旋体菌株39株，分别来自于四川、江西、湖南3个省市的2006～2008年菌株。

1.2 主要试剂PCR Premix购自宝生物工程（大连）有限公司；100bp DNA Marker购自北京天根生化科技有限公司；基因组提取采用硅胶膜型TM基因组DNA提纯试剂盒，购自北京赛百盛基因技术有限公司。

1.3 菌体DNA制备 采用EMJH液态培养基28℃培养7～10d，在对数生长期对菌体提取DNA，操作方法按试剂盒说明书进行。

1.4 MLST位点的选择及PCR扩增 参考2013年Boonsilp等报道的国际通用MLST研究方案［1］，选用7个管家基因位点pntA、sucA、pfkB、tpiA、mreA、gluM、caiB进行PCR扩增，各位点信息见表1，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。采用20μL反应体系进行扩增检，Premix Ex Taq10.0μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板1μL，纯水补充至20μL反应体积。PCR扩增程序如下：95℃ 预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。

表1 MLST分析中7个位点引物信息Tab.1 Primers of seven loci in MLST analysis

1.5 PCR产物检测、测序、序列拼接 扩增产物阳性者直接纯化、测序，采用双向测通方法，由宝生物工程（大连）有限公司完成。利用contig软件进行序列检查、拼接，采用DNAStar软件中的MegAlign模块进行序列截取。

1.6 数据分析 将7个管家基因位点序列与MLST网站http：//www.mlst.net/上相应等位基因进行比较，获得每株菌的等位基因谱（gluM－pntA－sucA－tpiA－pfkB－mreA－caiB），确 定 序 列 的ST型别。应用eBURST软件分析各ST型别间的种群结构及亲缘进化关系。利用BioNumerics软件进行聚类分析，观察菌株间的基因多态性情况。

2 结 果

2.1 MLST中7个位点等位基因情况 经序列比对分析发现，39株黄疸出血群菌株中，7个位点的多态性尚可，等位基因数目介于2～4之间，mreA位点多态性最高，呈现出4个等位基因，glmU位点的多态性最低，为2个等位基因，见表2。

2.2 基因多态性分析 MLST基因分型分析发现，39株黄疸出血群钩端螺旋体菌株呈现5个ST型别，其中ST1为主要的优势ST型别，占53.85%（21/39），其次依次为 ST143占 17.95%（7/39）、ST128占12.82%（5/39）、ST17占12.82%（5/39）、ST209占2.56%（1/39）。地区间ST 分布不尽相同，四川、江西地区以ST1为优势型别，湖南地区以ST128为主要优势型别，详见表3。

表2 MLST中每个位点的等位基因情况Tab.2 Number of unique alleles at each locus in MLST analysis

表3 39株黄疸出血群钩端螺旋体菌株ST型别情况Tab.3 Number of sequence types（STs）for 39 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhag isolates

2.3 eBURST软件分析 结果显示：39株菌株分为2个Clonal complexes和1个singleton，见图1。其中Group1占66.67%（26/39），包含ST1、ST128两个ST型别，来自于四川、江西、湖南三个地区；Group2占20.51%（8/39），包含 ST143、ST209两个ST型别，全部来自于2006～2007年江西菌株；一个单独的 singleton，占 12.82%（5/39），仅由ST17组成，全部来自于2007～2008年江西菌株，该singleton与其他两个Group亲缘进化关系较远，为一个独立的克隆群。

图1 39株黄疸出血群钩端螺旋体eBURST分析Fig.1 eBURST analysis of 39 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhag isolates

2.4 BioNumerics软件分析 采用UPGMA聚类分析发现：39株菌株共分为3个Group群5种基因型，见图2。UPGMA聚类图中的分群结构与eBURST分析结果一致。Group1包括ST128和ST1共2种基因型；Group2包括ST143和ST209共2种基因型，全部为2006～2007年江西菌株；Group3包括ST17仅1种基因型，全部为2007～2008年江西菌株。由聚类图显示：ST1同时分布于四川、江西、湖南三个地区，为本研究中南方地区的优势ST型别；ST143、ST209和ST17三个ST型别仅分布在江西地区；而ST128仅分布于湖南地区，因此在一定程度上MLST基因型别存在明显的地域性差异。

图2 39株黄疸出血群钩端螺旋体UPGMA聚类分析Fig.2 UPGMA dendrogram of 39 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhag isolates

3 讨 论

多位点序列分析（MLST），主要应用于菌株种群结构、亲缘进化关系、流行病学溯源等研究领域。黄疸出血群是中国钩端螺旋体病的主要致病性血清群，占历年来所发病例的60%以上［2］。本研究采用MLST技术对我国四川、江西、湖南三个地区2006～2008年的39株黄疸出血群钩端螺旋体菌株进行基因分型，结果发现7个位点多态性较好，39株分离株呈现3个克隆群5种ST型。

有MLVA研究报道，细菌基因型与地理分布有一定的相关性［3］。在本次MLST研究中，我们同样发现MLST基因型呈现一定的地域性特征，而同一地区内部菌株的ST型别相似性度较高。由聚类图显示：ST1为本研究中南方三个省份的优势ST型别，占53.85%（21/39），与李世军等［4］2012年报道分离自贵州的3株黄疸出血群菌株均为ST1型别相一致，推测可能ST1型别在外界气候、自然环境以及宿主环境变迁中具有较好的生存优势，因而普遍分布于南方多个省份。从不同地区ST型别多态性来看，存在明显的地域性差异。四川、湖南的ST型别相对单一，四川地区仅呈现ST1一种型别，湖南地区仅呈现ST128和ST1两种ST型别，eBURST种群结构分析发现：ST128和ST1均隶属于Group1克隆群，亲缘进化关系较近，而江西地区的ST型别多态性较高，呈现出ST1、ST17、ST143、ST209共四个型别，48.15%（13/27）的江西菌株隶属于Group2和一个单独的singleton，与Group1的亲缘进化关系较远。地区间ST型别的差异可能是由于菌株的自身遗传变异与当地区域性的气候、环境变迁存在一定的相关性，具体的原因还有待进一步的深入研究验证。Voronina等［5］2014年对来自于俄国的11株黄疸出血群菌株进行MLST研究，共发现ST17、ST199、ST23和ST206四种ST型别。Romero等［6］2011年对1986～2009年间法国圣保罗地区的90株黄疸出血群菌株研究发现，只呈现ST17一种ST型别。Caimi等［7］2012年对1993～2005年间阿根廷的3株黄疸出血群菌株进行基因分型研究，仅发现ST17一种ST型别。综合国内、国际ST型别研究结果发现，中国黄疸出血群菌株基因多态性较高，除ST17作为优势型别在中国及世界其他多个国家广泛分布外，某些国家仍存在一些独特的ST型别，呈现一定程度的地理分布特征。

Thaipadungpanit等［8］对泰国东北部2000～2005年的钩体疫情进行MLST研究，结果发现ST34为主要的优势克隆群，隶属为秋季群菌株，提示MLST分型方法可作为流行病学溯源的有力工具。本研究的菌株主要来自于中国钩端螺旋体病国家级哨点监测现场，涉及的菌株为流行病学非关联的监测菌株，本研究中之所以每个地区内部的ST型别高度相似，可能是由于当年的分离菌株均来自于同一时间同一个监测现场，宿主栖息生存的自然环境极其相似，因而在分子遗传水平上高度相似，该MLST方法是否可进一步应用于钩体病的流行病学溯源，尚需要适当数量的疫情暴发关联菌株来进一步验证。

通过本次基因分型研究发现，目前国际通用的MLST方案可初步应用于中国致病性钩端螺旋体的基因多态性、种群结构分析。虽然MLST在中国的应用还处于初级阶段，尚需要扩大适当数目的菌株量来验证其实用性，但是与传统的血清学分类方法相比，该方法操作简单、成本低廉，不用培养大量的钩体菌，实验结果可在不同实验室间比对，将逐渐成为钩端螺旋体实验室网络监测、分子流行病学研究的有利工具。

［1］Boonsilp S，Thaipadungpanit J，Amornchai P，et al.A single multilocus sequence typing（MLST）scheme for seven pathogenic Leptospira species［J］.PLoS Negl Trop Dis，2013，7（1）：e1954.DOI：10.1371/journal.pntd.0001954

［2］Zhang C，Wang H，Yan J.Leptospirosis prevalence in Chinese populations in the last two decades［J］.Microbes Infect，2012，14（4）：317－323.DOI：10.1016/j.micinf.2011.11.007

［3］Zhang CC，Nie YX，Li XW，et al.Application of multiple－locus variable－number tandem repeat analysis（MLVA）for molecular typing ofLeptospira interrogansserogroup Icterohaemorrhag［J］.Chin J Microbiol Immunol，2009，29（12）：1144－1147.DOI：10.3760/cma.j.issn.0254－5101.2009.12.025（in Chinese）张翠彩，聂一新，李秀文，等.黄疸出血群钩端螺旋体MLVA分型研究.中华微生物学和免疫学杂志，2009，29（12）：1144－1147.

［4］Li SJ，Zhang CC，Li XW，et al.Molecular typing ofLeptospira interrogansstrains isolated fromRattus tanezumiin Guizhou Province，Southwest of China［J］.Biomed Environ Sci，2012，25（5）：542－548.DOI：10.3967/0895－3988.2012.05.007

［5］Voronina OL，Kunda MS，Aksenova EI，et al.The characteristics of ubiquitous and uniqueLeptospirastrains from the collection of Russian centre for leptospirosis［J］.Biomed Res Int，2014，2014：649034.DOI：10.1155/2014/649034

［6］Romero EC，Blanco RM，Galloway RL.Analysis of multilocus sequence typing for identification ofLeptospiraisolates in Brazil［J］.J Clin Microbiol，2011，49（11）：3940－3942.DOI：10.1128/JCM.01119－11

［7］Caimi K，Varni V，Melendez Y，et al.A combined approach of VNTR and MLST analysis：improving molecular typing of Argentinean isolates ofLeptospira interrogans［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2012，107（5）：644－651.

［8］Thaipadungpanit J，Wuthiekanun V，Chierakul W，et al.A dominant clone ofLeptospira interrogansassociated with an outbreak of human leptospirosis in Thailand［J］.PLoS Negl Trop Dis，2007，1（1）：e56.