马爱静，王 艳，王 毅，李东迅,许华青,袁雪娇，刘 凯，叶长芸

北京市一些地区生肉标本中单增李斯特菌的分离及其分子流行病学特征分析

马爱静1，王 艳1，王 毅1，李东迅2,许华青3,袁雪娇1，刘 凯1，叶长芸1

目的 了解北京市一些地区生肉中单增李斯特菌的污染情况及其分子流行病学特征。方法 采用北欧食品分析标准(NMKL)对北京市一些地区采集的340份牛、羊、猪、鸡和鸭生肉标本进行单增李斯特菌的分离鉴定，并对分离菌株进行血清学分型(Serotyping)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)分型及多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)分析。结果 生肉标本中单增李斯特菌污染率为6.2%(21/340)。分离菌株含3种血清型(1/2a，1/2b和1/2c)，以1/2c为优势血清型(占47.6%)。PFGE分析中，使用内切酶AscI酶切电泳将21株单增李斯特菌分为12个型别，可聚类为3个群。MLST分析将21株单增李斯特菌分为7个ST型，其中 ST9型最多(10株)。结论 北京市一些地区的生肉类食品中存在6.2%的单增李斯特菌污染率，这些单增李斯特菌以家系II菌株占据绝对优势(80.1%)，其中1/2c型，GX6A16.CN0004和ST9型分别为血清型、PFGE带型以及MLST序列型的优势型别，与我国食源性单增李斯特菌的优势菌群特征一致。

单增李斯特菌；血清型分型；脉冲场凝胶电泳分型；多位点序列分型

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)属于李斯特菌属，是一种兼性厌氧的革兰氏阳性短杆菌，不形成芽孢和荚膜[1]。该菌在生冷食品和环境中广泛存在，可侵袭人和哺乳动物细胞，导致人类和动物的李斯特菌病[1-2]。李斯特菌的易感人群为孕妇、新生儿、老人以及免疫低下的人，可导致发热性胃肠炎、败血症、脑膜炎、流产等，死亡率较高[3-4]。自1929年丹麦首次报道人类感染性李斯特菌病后，该菌引起的感染病例呈上升趋势[1]。1981年加拿大沿海省份的一起李斯特菌病的暴发证实单增李斯特菌可通过食物在人群中传播[5-6]。1983-2011年间，美国、加拿大、欧洲相继报道了12起李斯特菌病的暴发[7-18]。单增李斯特菌也被世界卫生组织列为重点监测的食源性病原菌之一[19]。我国于2000年建立了包括单增李斯特菌在内的全国食源性致病菌监测网。

研究显示，食入被单增李斯特菌污染的食品是目前引起人类李斯特菌病暴发和散发的重要因素[20-21]。为了解生肉类食品中单增李斯特菌的污染情况及菌株的分子流行病学特征，本研究采集了北京市一些地区农贸市场及超市的生肉类食品(猪、牛、羊、鸡、鸭肉)，对其进行单增李斯特菌的检测，并对分离到的菌株进行血清学、PFGE以及MLST分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 自2013年11月-2014年4月从北京市不同农贸市场及超市共采集340份生肉类样品(牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉)，为了使样本具有充分发散性，采样时将同一采样时间、同一摊位、同种类且来自同一切割部位的生肉记为一份样本，具体信息见表1。

1.1.2 参考菌株 单增李斯特菌参考菌株EGD-e购自美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，作为单增李斯特菌阳性对照菌株，由本实验室保存。

1.1.3 试剂 FRASER BROTH BASE、BRILLIANCETMLISTERIA AGAR BASE培养基购自英国OXOID公司；脑心浸液购自北京陆桥技术有限公司；2×TaqMasterMix购自北京康为世纪公司；APIListeria生化试剂条购自法国bioMérieux公司；Goldview DNA染料、DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司；PCR引物合成、PCR产物纯化及测序由北京天一辉远生物科技有限公司完成。

1.1.4 主要仪器 Labcycler PCR仪购自德国圣欧国际有限公司；电泳槽购自北京博思公司，Gel Doc XR 凝胶成像仪购自美国伯乐公司；脉冲场凝胶电泳仪为CHEF DRIIIsystem(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统为Gel Doc XR+ System(美国Bio-Rad公司)；水浴摇床为Grant OLS2000(英国Grant公司)；浊度仪为Densimat(法国BioMérieuxVitek公司)。

1.2 方法

1.2.1 单增李斯特菌的分离培养 参照北欧食品分析标准(NMKL)中单增李斯特菌的分离方法：称取25 g不同生肉标本接种至225 mL增菌液(Half Fraser’s broth, Oxoid, Hampshire, UK)，30 ℃、220 r/min恒温摇床培养24 h。取1 mL增菌液将其接种至10mL Fraser增菌液中，37 ℃、220 r/min恒温摇床培养48 h。取10 μL Fraser增菌液接种至李斯特菌固体显色培养基上，37 ℃培养24～36 h，挑取可疑菌落(周围有透明晕环的蓝色菌落)接种至脑心浸液固体培养基传代两次进行纯化。

1.2.2 菌株鉴定 刮取适量纯培养物至100 μL无菌去离子水中振荡混匀，100 ℃沸水中煮10 min，12 000 r/min离心5 min，收集上清，-20 ℃保存备用。提取核酸后用李斯特菌属及单增李斯特菌的种特异性引物进行PCR扩增初步鉴定[22]。对扩增结果为阳性的分离菌，采用APIListeria生化鉴定试剂条进行单增李斯特菌种水平的鉴定。

PCR反应体系(20 μL)：2×Taq Master Mix 10 μL、无菌蒸馏水7 μL、上下游引物(10 μmoL/μL)各1 μL、模板DNA 1 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR反应结束后取6～8 μL扩增产物上样于2.0%琼脂糖凝胶(阳性参考菌株扩增产物作为对照)，220 V电泳20 min，使用凝胶图像分析系统读取结果。

1.2.3 血清型鉴定 对所有分离得到的单增李斯特菌，采用日本Denka Seiken公司的血清抗体，按照产品说明书进行血清型鉴定。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)分析 根据美国CDC PulseNet的标准操作规程对单增李斯特菌进行脉冲场凝胶电泳分型分析。选用限制性核酸内切酶AscI对菌株进行酶切电泳，PFGE图像用BioNumerics(Version5.0)软件根据UPGMA(Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages)方法进行聚类分析。

1.2.5 多位点序列分型(MLST)分析 单增李斯特菌的多位点序列分型分析方法参照法国巴斯德研究所的单增李斯特菌多位点序列分型数据库操作流程(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html)，选择7个管家基因(abcZ,blgA,cat,dapE,dat,ldh,lhkA)部分片段序列进行PCR扩增[23]。PCR产物经纯化后，进行双向测序。测序结果分析时，用SeqMan II(DNAStar Inc., Madison, WI, USA)软件并结合菌株等位基因的正反向序列图谱对等位基因序列进行拼接和校正，将整理好的序列与单增李斯特菌MLST数据库进行比对，确定每个管家基因的序列号。7个管家基因序列号的组合即为该菌株的ST型。采用BioNumerics软件将本研究分离的21株单增李斯特菌株和其他不同ST型别的中国单增李斯特菌株[24]构建最小生成树,见图2。

2 结 果

2.1 菌株分离情况 本实验采集的340份标本共分离到21株单增李斯特菌，阳性率为6.2%。其中8株分离自鸡肉，分离率为22.2%；6株分离自牛肉，分离率7.5%；6株分离自猪肉，分离率为5.0%；1株分离自羊肉，分离率为1.1%。不同食品样品中单增李斯特菌的分离情况详见表1。

2.2 血清型分型 21株单增李斯特菌分为3种血清型(1/2a，1/2b和1/2c)，主要血清型为 1 /2c和1 /2a，分别有10株(47.6%)和7株(33.3%)，1/2b血清型有4株(19.0%)(表1)。

2.3 PFGE分型 21株单增李斯特菌使用AscI酶切电泳后分为12种PFGE型别(GX6A16.CN0004,GX6A16.CN0009,GX6A16.CN0011,GX6A16.CN0018,GX6A16.CN0019,GX6A16.CN0029,GX6A16.CN0030,GX6A16.CN0046,GX6A16.CN0054,GX6A16.CN0192,GX6A16.CN0254,GX6A16.CN0284)，见图1。其中GX6A16.CN0004为主要型别(7株)。采用BioNumerics进行菌株间聚类分析，可将21株菌的12种PFGE带型分为3个群，各群包含菌株数不等，其中群I菌株数最多，包括15株菌(5株1/2a型，10株1/2c型)。群II包含4株菌，其中3株为ST87，1株为ST3，血清型皆为1/2b。群III包括2株菌，皆为ST155型，1/2a血清型(图1)。

2.4 MLST分型 经MLST分型分析，21株单增李斯特菌分为7个ST型，包括10株ST9型、3株ST87型、2株ST155型、2株ST101型、2株ST121型、1株ST8型、1株ST3型，其中ST9型为优势ST型(见表1、图1)。最小生成树结果显示，本研究中所分离到的单增李斯特菌株皆分布于我国已报道的单增李斯特菌主要克隆群[24]，且分别属于家系I和家系II。

注：*将本研究所分离的21株单增李斯特菌使用内切酶AscI进行PFGE分析，并根据UPGMA方法进行聚类分析。相应的菌株名称、PFGE型别、菌株来源、ST型别以及血清型见图右侧。

*The 21L.monocytogenesisolates from this study were analyzed by PFGE usingAscI. The dendrogram were constructed using UPGMA. The corresponding isolate, pulse types, source, STs and serotypes were shown alongside the dendrogram on the right.

图1 21株单增李斯特菌的PFGE聚类图、ST型和血清型

Fig.1 Dendrogram of PFGE patterns, MLST types and serotypes of 21L.monocytogenesstrains

注：*每个圆圈中的数字据代表一种ST型，圆圈大小代表菌株数量，圆圈周围的阴影区域表示区域内的ST型属于同一克隆群(Clone complex，CC)。圆圈内不同的颜色表示不同L.monocytogenes来源。

* Each circle corresponds to a sequence type. The size of the circle is proportional to the number of the isolates. The shadow zones in different color correspond to different clonal complexes, and the color within the cycles represents the sources of theL.monocytogenes.

图2 基于MLST型别的遗传进化分析

Fig.2 Genetic relationship of the isolates based on MLST

3 讨 论

单增李斯特菌作为李斯特菌属中对人致病的菌种，可以侵入宿主细胞，导致李斯特菌病，致死率较高，且在食品中污染较为严重[1,7-8,25]。本次调查的生肉类食品中单增李斯特的污染率为6.2%，且在生牛肉、生羊肉、生鸡肉、生猪肉中均检出单增李斯特菌，以鸡肉的污染率相对较高。显示生肉类等食品中存在明显的单增李斯特菌污染现象，因此食品行业中此类生肉质食品加工过程中一定要注意与熟食分开，避免直接食用被单增李斯特菌污染的熟食。本研究中的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉中单增李斯特菌的检出率低于崔京辉等于2004～2006年对北京市西城区生肉中单增李斯特菌的检出率[25]，分析可能与本次调查的采样时间为冬春季节，气温较低不利细菌生存繁殖有关。

本研究中分离出的21株单增李斯特菌血清型主要为1/2c，其次为1/2a型，而部分西方国家单增李斯特菌则为1/2a型占有绝对优势，1/2c血清型则相对较少[26]。表明我国食源性单增李斯特菌的血清型别组成与其他国家有所差异。PFGE分型分析可以反映出菌株核酸间的相似度，因而可作为暴发时菌株溯源的依据。本研究中所分离的单增李斯特菌株PFGE型别以GX6A16.CN0004为优势型别，与我国食源性单增李斯特菌的优势型别一致[24]。多位点序列分型分析发现，本次调查中所分离的菌株，以ST9型为主，其血清型皆为1/2c。从最小生成树可以看出这些菌株主要集中在家系I和家系II(图2)。PFGE结果聚类分析显示，群II所含菌株包括ST3和ST87两个型别(图1)，血清型均为1/2b，是引起人类李斯特菌病的常见血清型，这4株菌均从鸡肉中分离获得，应对此污染现象加以重视。21株分离株中有6株菌的PFGE、MLST以及血清型结果均相同，这些菌株分别来自同一地区猪肉、牛肉、鸡肉3种不同的生肉样本，且采样时间为同一天。由于部分标本采集的背景信息不完整，无法确定这几株菌是否是来自于同一超市或者市场(及摊位)的标本，推测可能部分市场或者超市的各种生肉食品存在相同的污染来源，或者同一超市或市场生肉食品间存在交叉污染的可能性。因此各超市或者市场中不同生肉食品的分类储存很有必要。

单增李斯特菌作为重要的食源性病原菌之一，得到了WHO 和各国的高度重视。美国将单核细胞增生李斯特菌列为7种主要食源性致死病原菌之一，由此菌引起的李斯特菌症病例呈上升趋势[19]。我国自2000年建立全国食源性致病菌监测网以来，对单增李斯特菌的监测力度逐年加大。本次研究结果显示，单增李斯特菌在生禽畜肉类食品中存在不同程度的污染，应当加强对生肉类食品的生产及销售环节的病原学监测，以预防食源性李斯特菌病的发生，降低暴发感染的风险。

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Molecular epidemiological characteristics ofListeriamonocytogenesisolated from raw meat samples in some regions of Beijing, China

MA Ai-jing1,WANG Yan1,WANG Yi1,LI Dong-xun2,XU Hua-qing3,YUAN Xue-jiao1,LIU Kai1,YE Chang-yun1

(1.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;2.Department of Microbiology, Medical College of Guiyang, Guiyang 550004, China;3.Department of Dermatology, the Sixth People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450000, China)

Listeriamonocytogenes(L.monocytogenes) is one of the most significant human pathogenic bacteria, as it causes serious invasive illnesses and is mainly transmitted through the food chain. Thus, an epidemiologic study, which investigates the prevalence and molecular characteristics of this pathogen involving raw materials contamination, is extremely required to ensure food safety, evaluate the potential health risk, and provide the control strategies. A total of 340 raw meat samples, including pork, beef, lamb, chicken and duck products, were collected from several local markets in Beijing, and theNMKLNo. 136 method was selected for the isolation ofL.monocytogenesfrom various raw meat samples. Then, the serological classification, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis and multi-locus sequence typing (MLST) were performed to provide the valuable strain discrimination. Among 21 strains ofL.monocytogenesisolated, accounting for 6.2% (21/340) contamination rate, three serotypes were detected and distinguished, including serovars 1/2a (7), 1/2b (4) and 1/2c (10), and the serotype 1/2c accounted for 47.6% of all isolates. The PFGE typing byAscIdivided the 21 isolates into 12 pulse types (PTs) that were assigned to 3 clusters. The result of MLST showed 7 different sequence types and the predominant STs was ST9 (10). Accordingly, the food sources contaminated byL.monocytogeneswas confirmed in Beijing by our study, and serotype 1/2c, GX6A16.CN0004 and ST9 were the predominant serotype, pulse type and sequence type, respectively. The result of molecular subtypes indicated that common serotypes, PTs and STs in Beijing had the similar prevalent trends as that in rest of China.

Listeriamonocytogenes; serotype; PFGE; MLST

Ye Chang-yun, Email: yechangyun@icdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.003

国家重大传染病防治科技重大专项(No.2011ZX10004-001,No.2013ZX10004-101)联合资助

叶长芸，Email：yechangyun@icdc.cn

1.传染病预防控制国家重点实验室，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 102206； 2.贵阳医学院微生物学教研室，贵阳 550004； 3.郑州市第六人民医院皮肤性病科，郑州 450000

R378

A

1002-2694(2015)05-0403-05

2015-01-05；

2015-03-16

Supported by the National Major Science and Technology Project of Prevention and Control in Significant Infectious Disease (Nos. 2011ZX10004-001 & 2013ZX10004-101)