樊 华，国九英，马素丽，张 楠，安春丽

人工合成肺孢子菌p55抗原串联基因真核表达载体的构建及表达

樊 华1,2，国九英1，马素丽1，张 楠1，安春丽1

目的 研究肺孢子菌p55抗原人工合成串联基因的真核表达载体构建及其表达鉴定。方法 从肺孢子菌p55蛋白5个变异体中选取可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用抗原表位，串联合成一段多表位基因，命名为TAG。将TAG双酶切后克隆到pIRES-hrGFP-1a真核表达载体，构建重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG,将重组质粒转染至感受态TG-1大肠杆菌中进行扩增后，经提取纯化质粒再转染至HEK293细胞，用Western blot鉴定蛋白表达水平。结果 构建的pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒经酶切后测序鉴定，证明其序列正确，成功转染至HEK293细胞，Western blot检测其在HKE293细胞中能进行有效基因表达。结论 本研究构建了pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒，并在HEK293细胞中成功表达，为进一步阐明TAG的免疫保护功能以及核酸疫苗的研究奠定基础。

肺孢子菌；p55抗原；串联抗原基因；真核表达

肺孢子菌肺炎(Pneumocystispneumonia, PCP) 是由肺孢子菌引起的一种机会感染性肺炎[1]。常见于艾滋病、恶性肿瘤、器官移植及其他免疫功能不全的人群[2-3]。在艾滋病全病程中均可合并PCP，且可经历多次反复发病。根据最新的数据[4]，PCP的发病率不仅在HIV感染者中逐年增加，而且在非HIV感染的免疫抑制人群中也在不断增多。目前PCP传统的防治药物不仅副作用很大，而且耐药突变株已经或正在产生，使PCP的治疗变得极为困难。由于缺少可靠、稳定的连续的体外培养体系，迄今体外培养技术难以提供大量肺孢子菌抗原，用肺孢子菌可溶性抗原或活肺孢子菌进行免疫在实际工作中受到限制[5]。因此，新的治疗方法的研究就变得非常重要。Smulian等[6]和Theus等[7]发现肺孢子菌55 kDa蛋白(p55)作为肺孢子菌的主要抗原成分之一，能刺激宿主产生抗肺孢子菌的保护性免疫反应，而且重组p55蛋白能刺激宿主产生较强的免疫反应。因此, p55做为PCP预防疫苗的候选抗原成为研究热点。

本研究应用生物信息学方法，分析肺孢子菌p55蛋白，参考GenBank 发布的5个变异体，选择可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用并具有较好抗原性参数的区域作为候选抗原表位，将各表位进行串联后形成嵌合体，合成了多表位串联基因，命名为TAG。在此基础上，我们构建了该蛋白的原核表达载体[8]，期望为制备蛋白疫苗打基础。但因表达蛋白量少及回收的困难，难以满足蛋白疫苗的需求。因此，本文构建了pIRES-hrGFP-1a/TAG的重组真核表达载体，并转染HEK293细胞，检验重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG在真核细胞中的表达水平。以期为该基因疫苗的免疫特性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 基因、菌株、细胞及载体 人工合成p55抗原串联基因(本实验室已成功合成并测序证明，命名TAG)，EsherichiacoliTG-1菌株(本实验室保存)，HEK293细胞(细胞生物教研室提供)，质粒载体pIRES-hrGFP-1a(Agilent公司)

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamHI和XhoI、T4DNA连接酶、耐热TaqDNA聚合酶、AntiFLAG-Ab、HRP标记羊抗兔IgG、PVDF膜购自大连宝生物工程有限公司，质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根生物公司，转染试剂购自QIANGEN公司。其他常规试剂购自沈阳化学试剂采购供应站。

1.2 方法

1.2.1 pIRES-hrGFP-1a/TAG真核表达载体的构建 取适量TAG基因和pIRES-hrGFP-1a质粒，分别用BamHI和XhoI双酶切。再进行连接反应:10×T4DNA连接酶buffer 1 μL，T4DNA连接酶(20 U/μL)1 μL，双酶切的pIRES-hrGFP-1a 1 μL，双酶切的基因片段5 μL，双蒸水补足10 μL体系；并以水代替目的基因片段作为对照。构建重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG，与标签FLAG连接。

1.2.2 重组表达质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG的鉴定 将pIRES-hrGFP-1a/TAG转化至感受态大肠杆菌E.coliTG-1内。用含重组质粒的E.coli涂布于含有氨苄青霉素( Amp, 100 μg/ mL) 的LB培养基( 1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl)，于37 ℃培养箱中过夜培养。收获大肠杆菌并抽提重组表达质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG。用BamHI和XhoI双酶切重组表达质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG，进行琼脂糖凝胶电泳初步鉴定并测序。

土壤孔隙率:用已知容积(V)的环刀切削土壤,使土样充满环刀,再用天平称量环刀中土壤的重量(m1),在烘箱(105°C)中烘干土壤水分,称量烘干后土壤的重量(m2).再将环刀垂直全部压入土样,将土装入容器(记容器重量为m3),在烘箱(105°C)中烘干土壤水分至恒重记为m4,则

1.2.3 重组表达质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG转染HEK293细胞 HEK293细胞常规培养传代，至细胞60%～70%融合，采用创新阳离子脂质体转染法，参照QIANGEN说明书分别将构建的重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG质粒和pIRES-hrGFP-1a空质粒转染HEK293细胞，转染完毕加入10%小牛血清DMEM培养液继续培养48 h后，收集细胞培养液上清 。

1.2.4 TAG基因蛋白的检测 收集稳定转染的细胞培养液上清和转染空质粒pIRES-hrGFP-1a的对照组细胞培养液上清，1 000×g离心10 min收集上清，丙酮法浓缩细胞培养液中蛋白。样品蛋白在10%SDS-PAGE上分离后湿转到PVDF膜上，以AntiFLAG-Ab为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG-HRP为二抗，进行蛋白质印迹。

2 结 果

2.1 重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG的双酶切鉴定及测序 pIRES-hrGFP-1a载体片断长度约5 000 bpTAG基因片段长度为1 180 bp。重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG，经BamHI和XhoI双酶切的电泳结果出现了约5 000 bp及1 180 bp的特异性条带(见图1)，pIRES-hrGFP-1a/TAG表达载体构建成功。同时，重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG由北京华大基因生物工程有限公司作序列测定，结果证实了其碱基序列及读码框架与设计完全相符。

2.2 重组质粒用QIANGEN 阳离子脂质技术转染HEK293细胞 48 h后在荧光显微镜下观察hrGFP的表达情况。成功转染HEK293细胞中的重组质粒，其携带绿色荧光蛋白报告基因表达清晰，转染效率高(图2)。

2.3 重组质粒在HEK293细胞中表达的鉴定 Western blot检测重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG在细胞培养液中的表达，可见48 kDa处有明显的免疫杂交带出现，而空质粒pIRES-hrGFP-1a组HEK293细胞培养上清中未见明显条带(图3)。

M1: DNA Marker DL15000; M2: DNA Marker DL2000 1: pIRES-hrGFP-1a/ TAG digested withBamHI andXhoI; 2: pIRES-hrGFP-1a digested withBamHI andXhoI; 3: pIRES-hrGFP-1a/ TAG digested withBamHI alone; 4: pIRES-hrGFP-1a/ TAG digested withXhoI alone.

图1 重组真核表达载体pIRES-hrGFP-1a/TAG的酶切鉴定

Fig.1 Identification of recombinant eukaryotic expression vector pIRES-hrGFP-1a/TAG by enzyme digestion

A: Recombinant plasmids were transfected into HEK293 cells by fluorescence microscope; B: The same vision under the microscope.

图2 重组质粒转染HEK293细胞48 h后荧光显微镜观察hrGFP表达(×100)

Fig.2 Expression of hrGFP fluorescence microscopy of the recombinant plasmid transfected into HEK293 cells after 48 h (×100)

R: Transfection with recombinant plasmid pIRES-hrGFP-1a/TAG HEK293 cell culture supernatant; Con: Transfected with empty plasmid pIRES-hrGFP-1a HEK293cell culture supernatant.

图3 Western blot检测pIRES-hrGFP-1a/ TAG在HEK293细胞培养液上清中的表达

Fig.3 Western blot detection of pIRES-hrGFP-1a/ TAG expression in cultured supernatant in HEK293 cell

3 讨 论

肺孢子菌是一种机会性致病真菌，在免疫功能不全宿主可以引发严重的致死性PCP。直接接种肺孢子菌虽可以产生保护性免疫，但由于其不能在体外连续培养，制约了病原学的深入研究，全菌疫苗的研制受到很大的限制[9]。同时肺孢子菌的抗原成分复杂，抗原变异较大。目前对于PCP治疗及预防的关键需求就是要有更为创新的方法[10]。

利用肺孢子菌p55 或重组p55抗原来研究其作用机制及提高其能够提供的保护能力，是未来的发展方向，在预防PCP的疫苗研究中比肺孢子菌的主要表面糖蛋白(MSG,gpA) 更受青睐[11-14]。国内对PCP的基因疫苗研究中，有段义农等[15]采用基因克隆的方法构建肺孢子菌 p55抗原基因片段DNA疫苗，冯燕梅[16]选取5个p55蛋白变异体中的p55-v3抗原基因片段构建DNA疫苗，刺激机体均产生一定的体液免疫和细胞免疫。本研究分析p55抗原含5个变异体，从中选取具有较高的抗原性参数指标的细胞表位，人工串联后形成嵌合体TAG构建DNA疫苗，从理论上比单表位基因疫苗具有更好的免疫原性以及更好的抗蛋白变异体的能力，且可实现单价疫苗多价免疫的效果。为多表位串联基因的疫苗研制进一步奠定了基础，是PCP防治研究的创新性探索。

pIRES-hrGFP-1a是一种分子量为5.0 kb的真核表达载体。在上游启动子的控制下，其内部核糖体进入位点( internal ribosome entry site, IRES) 序列与其相连的基因可同时转录，以非依赖帽的方式，启动远端mRNA 的翻译，从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白。近年来多基因表达的重要方法，即采用IRES元件代替内部启动子克服了启动子间的抑制现象，尤其当需要目的基因与其后的选择标记基因共同翻译时。其Amp选择抗性和多克隆酶切位点能够克隆大片段目的基因。启动子CMV和SV40polyA信号可以在哺乳动物细胞中高表达重组蛋白。由于pIRES-hrGFP-1a携带有hrGFP(绿色荧光蛋白)标记基因，当把目的片段连接到MCS区域，在荧光显微镜下就可看到绿色荧光；而且IRES后的hrGFP标记基因得到表达，那么IRES元件前的目的基因也一定表达。迄今为止, 关于pIRES-hrGFP-1a的研究已经广泛涉及到临床各个方面。

本研究所采用HEK293细胞系，是进行外源性DNA真核表达最常用的宿主细胞之一。本研究成功构建重组表达质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG，采用更低毒性、转染率更高的QIANGEN生物公司的创新阳离子脂质技术瞬时转染细胞的方法转染HEK293细胞。结果表明pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒能成功转染体外培养HEK293细胞并在蛋白水平上检测到有效表达。这为进一步研究高效的抗原表位疫苗及人工合成串联基因TAG的免疫功能提供了基础。

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Construction and identification of eukaryotic expression plasmids of synthetic TAG gene ofPneumocystisp55 antigen

FAN Hua,GUO Jiu-ying,MA Su-li,ZHANG Nan,AN Chun-li

(Department of Medical Microbiology and Parasitology,College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang 110122, China)

We constructed eukaryotic expression plasmids of synthetic TAG gene ofPneumocystisp55 antigen to lay the foundation for the of vaccine research of nucleicPneumocystispneumonia. In a series of synthetic genes for the antigen gene TAG by double digestion, it was cloned in pIRES-hrGFP-1a eukaryotic expression vector to construct recombinant plasmids as pIRES-hrGFP-1a/TAG. After propagating inE.coliTG-1, the recombinant plasmids were transfected into HEK293 cells. After 48 h incubation, Western blot was performed to identify the expression of pIRES-hrGFP-1a/TAG antigenic gene. Results showed that construction of pIRES-hrGFP-1a/TAG recombinant plasmid was expressed by restriction enzyme digestion and sequencing, and the sequence was verifyed, successfully transfected into HEK293 cells. Western blot was used to test the effective gene expression in HKE293 cells. In this study, the recombinant plasmids of pIRES-hrGFP-1a/TAG are conducted successfully and expressed in the HEK293 cells, which provide a basis for clarification of immunologic function of pIRES-hrGFP-1a/TAG and study of DNA vaccine.

Pneumocystiscarinii; p55 antigen; tandem antigen gene; eukaryotic cell expression

An Chun-li, Email: cmucl@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.002

国家自然科学基金(No.81370189)资助

安春丽，Email：cmucl@126.com

1.中国医科大学基础医学院病原生物教研室，沈阳 110122; 2.黑龙江省齐齐哈尔市第一医院检验科，齐齐哈尔 161005

R382

A

1002-2694(2015)05-0399-04

2014-08-30；

2014-11-22

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 81370189)