殷汉华　何雅军　邓延梅　潘立武　刘序友　韩馥缦　叶国荣　吕　霞　舒建昌

姜黄素对肝星状细胞中髓样分化因子88蛋白表达的影响

殷汉华1何雅军2邓延梅2潘立武2刘序友2韩馥缦2叶国荣2吕霞2舒建昌2

目的观察姜黄素干预前后肝星状细胞（HSC）中髓样分化因子88（MyD88）蛋白的变化水平，以探讨姜黄素抗肝纤维化的相关机制。方法构建pCMV-Myc-MyD88重组质粒，将人肾上皮细胞293T细胞及HSC-T6细胞分别设为空白对照组、MyD88过表达组、姜黄素+MyD88过表达组，其中MyD88过表达组给予转染pCMV-Myc-MyD88重组质粒72 h，姜黄素+MyD88过表达组在转染48 h后加入姜黄素继续作用24 h。采用Western blot法检测MyD88蛋白表达。结果①转染pCMV-myc-MyD88重组质粒48 h后，MyD88在293T细胞及HSC中表达均明显增高（P＜0.05），且经姜黄素处理后两类细胞中表达量明显降低（P＜0.05）。②姜黄素处理后MyD88表达量较MyD88质粒转染组明显降低（P＜0.05）。结论姜黄素可能通过抑制肝星状细胞MyD88蛋白表达，阻断MyD88依赖性信号通路的转导而发挥抗肝纤维化的作用。

MyD88；姜黄素；肝星状细胞

肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纤维化发生发展的关键细胞［1］。姜黄素是由中药姜黄中提取的活性成分，是研究最多的天然化合物之一，具有广泛的药理作用，如诱导肿瘤细胞凋亡、抗氧化、清除氧自由基等［2-3］。我们前期的研究证实，姜黄素可以抑制HSC的活化增殖，使其停留在G2/M期，并诱导HSC凋亡，其作用具有时间和剂量依赖性［4-7］。Toll样受体（TLRs）主要表达于巨噬细胞、HSC等，属Ⅰ型跨膜蛋白，可通过MyD88依赖性和TRIF依赖性两条途径来传导细胞活化信号，与肝脏炎症损伤、肝纤维化发生发展有关［8-9］。本研究拟观察髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）蛋白在姜黄素作用前后其在HSC中表达的改变，从而探讨MyD88蛋白与姜黄素之间的关系，以进一步研究姜黄素的抗肝纤维化机制。

材料与方法

一、一般资料

1.细胞株

肝星状细胞株HSC-T6是由上海中医药大学徐列明教授馈赠，其具有活化HSC的表型；293T细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。

2.试剂

兔抗大鼠MyD88一抗（美国Santa Cruz公司），姜黄素（美国Sigma公司），siRNA Transfection Reagent（美国Santa Cruz公司），β-Actin内参一抗（美国EarthOX公司），质粒小提试剂盒（DPl03）［（天根生化科技（北京）有限公司］，逆转录试剂盒（美国Abcam公司），PCR扩增试剂盒（美国Abcam公司）。

二、方法

1.细胞培养

培养液选用含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2及饱和湿度，定期在倒置显微镜下观察细胞生长情况，根据生长状态进行换液，当细胞生长至密度达到80%～90%时即开始准备进行传代。

2.RT-PCR

将收集的细胞提取总RNA。参照逆转录试剂盒说明书行逆转录反应。取逆转录产物，根据Gen－Bank MyD88（No.AY191270.1）的功能编码区序列和载体pCMV-Myc序列特点，选择EcoRI-HF和KpnI作为酶内切位点，设计PCR引物序列如下：上游引物：5′-AAT TGA ATT CGG ATG TCT GCG GGA GGC CCC-3′，下游引物：5′-AAT TAA GGT ACC-TCA GGG CAG GGA CAG AGC-3′。参照PCR试剂盒说明书，获取PCR产物，进行电泳。将琼脂糖凝胶置于核酸/蛋白凝胶图像成像分析仪采集图像并保存。

3.构建重组质粒

影响企业生存和发展的因素还有企业创新。企业创新其实就是对商品使用价值的创新，即对商品有用性的创新，进一步讲就是创有效劳动之新。如果不是对有效劳动创新，企业不断重复的劳动可能就会变成无效劳动，生产的产品就是无用产品，产品销售不出去，就不能实现商品价值，最终受损的是商品所有者。创新商品使用价值，提高产品性能，提升商品原有的有用性，增加产品多样性，在市场上卖出更高的价格，从而获得更好的收益。国家提出供给侧结构性改革与创新使用价值在本质上是一致的。因此企业要想立于不败之地成为行业领军者，就要加强对使用价值的创新，不能抱残守缺。

将酶切MyD88 DNA片段及载体质粒及DNA回收后，连接MyD88 DNA片段及载体质粒，经质粒转化、筛选及质粒抽提后，重建质粒酶切鉴定及测序。

4.重建质粒转染至细胞

HSC-T6及293T常规培养传代，取对数生长期状态良好的细胞消化计数，采用无双抗培养基将细胞浓度稀释至8×104/mL，取2 mL/孔种6孔板，37℃，5%CO2及饱和湿度下的培养箱中培养24 h。分3组进行转染：①空白对照组；②重组质粒组；③重组质粒组+姜黄素组。取6 μL siRNA Transfection Reagent加入92 μL不含血清的DMEM中，另取12 μg重组质粒加入88 μL不含血清的DMEM中，将两者混合，轻轻吹打混匀，室温孵育25 min，加入800 μL DMEM中混匀，加入到6孔板中培养培养细胞8 h，更换含10%胎牛血清的无双抗培养液4 mL继续培养48 h。

5.Western bolt

收集各组细胞蛋白后，进行蛋白定量，配制SDS-PAG凝胶进行蛋白电泳，每孔上样20～30 μL，样本的两侧泳道加入预染的蛋白Markers作为指示参考。经转膜后孵育一抗，MyD88抗体溶液、β-Actin抗体溶液，置于4℃下的摇床上孵育过夜。次日，用TBST液2～3次，10 min/次。二抗孵育2 h，再以TBST液清洗2～3次，每次10 min，取等体积的ECL发光剂A液、B液并混匀，显影，设置曝光时间，采图并保存结果。使用相配套的Image Lab分析软件测定蛋白相对表达量。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件，所得数据均以x±s表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析或独立样本T检验分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、Pcmv-Myc-MyD88重组质粒的构建与鉴定

二、MyD88在293T细胞中的表达及姜黄素对其表达的影响

Western blot检测结果显示，瞬时转染pCMV-myc-MyD88重组质粒于293T细胞48 h后MyD88蛋白表达量较空白组明显增高（1.462±0.276 vs 0.438±0.087），姜黄素处理后其表达量较MyD88质粒转染组明显降低（0.734±0.157 vs 1.462± 0.276）（图1）。

图1　姜黄素对293T细胞中MyD88表达的影响（*与空白组比较，P＜0.05；#与MyD88质粒转染组比较，P＜0.05）

三、MyD88在HSC细胞中的表达及姜黄素对其表达影响

Western blot检测结果显示，瞬时转染pCMV-myc-MyD88重组质粒48 h后MyD88蛋白表达量较空白组明显增高（0.413±0.089 vs 0.847±0.131），姜黄素处理后其表达量较MyD88质粒转染组明显降低（0.847±0.131 vs 0.362±0.057）（图2）。

图2　姜黄素对肝星状细胞中MyD88表达的影响（*与空白组比较，P＜0.05；#与MyD88质粒转染组比较，P＜0.05）

讨论

本研究通过构建pCMV-myc-MyD88重组质粒并转染293T细胞及HSC-T6中使MyD88蛋白过表达，并以姜黄素干预前后检测其蛋白表达量的变化，以观察姜黄素对该蛋白表达的影响，从而确定姜黄素对HSC中MyD88依赖性信号通路的影响。

HSC活化是肝纤维化发生的中心环节。各种损伤因素通过不同方式和途径作用于肝脏，引起肝细胞、库弗细胞等损伤、坏死、凋亡及肝组织炎症反应，释放大量、多种细胞因子等，通过多种途径激活HSC并转化为肌成纤维样细胞，大量合成和分泌胶原等细胞外基质，最终引起肝纤维化、肝硬化。

人及哺乳动物存在一个TLR家族，可以识别病原菌，激活导致机体有效防御基因的转录，从而启动特异性和非特异性免疫反应抵抗病菌人侵。

Toll样受体（TLRs）主要表达于巨噬细胞、HSC等，属Ⅰ型跨膜蛋白，主要作用是识别不同的病原分子并发挥受体活化后的信号转导作用，通过识别入侵病原微生物的配体，激发天然免疫应答，启动促炎症细胞因子和共刺激分子的表达，可增强细胞因子的合成与释放能力并进而诱导炎症反应，是机体介导天然免疫转向获得性免疫的桥梁，其可通过MyD88依赖性和TRIF依赖性途径两条途径来传导信号活化，与肝脏的炎症损伤有关［8-9］。

TLRs的信号转导途径主要有两条，MyD88依赖性和TRIF依赖性。TLR l、2、5、7、9和10是通过MyD88依赖性途径。在MyD88依赖性途径中，MyD88是信号转导通路中的关键蛋白［10］。

肝脏组织内的实质细胞与非实质细胞中均可见TLR表达，如肝细胞表达TLR1-9，HSC表达TLR2与TLR4。在内毒素刺激下表达增加，同时活化细胞，通过细胞内信号转导最终活化NF-资B并调控反应性基因的转录，合成并分泌大量致纤维化的细胞因子，如TGF-β、TNF-α、ICAM-1、IL-1、IL-2、IL-8和IL-12等。再次通过一系列途径作用于成纤维细胞，促使其增殖并表达α-SMA，发生细胞表型的转化，从而分化为肌成纤维细胞，合成和分泌胶原蛋白，导致过量的细胞外基质在肝脏内沉积而致肝纤维化［11-12］。肠源性内毒素（主要成分为LPS）入肝后，可激活库普弗细胞，启动TLR4信号通路，分泌TNF-a、IL-1β等细胞因子。人活性HSC表达TLR4、CD14，并能识别LPS而分泌致炎细胞因子。HSC能直接识别LPS及其他TLR配体，并促进纤维组织增生［13］。

293T细胞就是一种表达SV40病毒T抗原的细胞系，来源于人胚胎肾细胞293HEK，经改造后在其中插入了T抗原，用293T细胞进行转染可以获得较高的表达水平。293T细胞可用于筛选稳定表达的细胞系。在本研究中293T细胞用于检测转染效率并作为对照组。结果发现将pCMV-myc-MyD88重组质粒并转染HSC-T6及293T后MyD88蛋白表达量明显增加（P＜0.05），予以姜黄素作用后检测MyD88蛋白表达量下降（P＜0.05），说明姜黄素可以降低MyD88蛋白的表达，从而抑制MyD88依赖性信号通路，进而抑制HSC的活化、增生等，这可能是姜黄素发挥抗肝纤维的作用的机制之一，具体的分子机制需进一步研究。

本研究从姜黄素与MyD88的关系入手，发现姜黄素可抑制MyD88蛋白表达，可能是姜黄素抗肝纤维的作用机制之一，并且有助于进一步探讨将TLRs和MyD88蛋白作为早期诊断肝纤维化的指标，或作为治疗肝纤维化的靶点之一。

1Ray K.Liver：hepatic stellate cells hold the key to liver fibrosis.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2014，11（2）：74.

2Heger M，van Golen RF，Broekgaarden M，et al.The molecular basis for the pharmacokinetics and pharmacodynamics of curcumin and its metabolites in relation to cancer.Pharmacol Rev，2014，66（1）：222-307.

3Esatbeyoglu T，Huebbe P，Ernst IM，et al.Curcumin--from molecule to biological function.Angew Chem Int Ed Engl，2012，51（22）：5308-5332.

4吕霞，舒建昌，付景，等.姜黄素对人肝星状细胞株LX-2瘦素和脂联素表达的影响.广东医学，2013，34（11）：1641-1644.

5舒建昌，吴海恩，皮新军，等.姜黄素抑制肝纤维化大鼠脂质过氧化物的生成及肝脏TGF-β1和PDGF的表达.中国病理生理杂志，2007，23（12）：2405-2409.

6舒建昌，叶国荣，吕霞，等.姜黄素治疗肝纤维化及其作用机制的初步研究.中华肝脏病杂志，2007，15（10）：753-757.

7何雅军，舒建昌，吕霞，等.姜黄素预防肝纤维化作用与肝星状细胞的关系.中华肝脏病杂志，2006，14（5）：337-340.

8Könner AC，Brüning JC.Toll-like receptors：linking inflammation to metabolism.Trends Endocrinol Metab，2011，22（1）：16-23.

9Mencin A，Kluwe J，Schwabe RF.Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases.Gut，2009，58（5）：704-720.

10 Netea MG，Wijmenga C，O′Neill LA.Genetic variation in Toll-like receptors and disease susceptibility.Nat Immunol，2012，13（6）：535-542.

11 Mai CW，Kang YB，Pichika MR.Should a Toll-like receptor 4（TLR-4）agonist or antagonist be designed to treat cancer？TLR-4：its expression and effects in the ten most common cancers.Onco Targets Ther，2013，6，1573-1587.

12 Brenner C，Galluzzi L，Kepp O，et al.Decoding cell death signals in liver inflammation.J Hepatol，2013，59（3）：583-594.

13 Nakamoto N，Kanai T.Role of toll-like receptors in immune activation and tolerance in the liver..Front Immunol，2014，5：221.

Effects of curcumin on the expression of myeloid differentiation factor 88 protein in hepatic stellate cells

YIN Han-ping1，HE Ya-jun2，DENG Yan-mei2，PAN Li-wu2，LIU Xu-you2，HAN Fu-man2，YE Guo-rong2，LV Xia2，SHU Jian-chang2.
1）Heyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine；
2）Department of Gastroenterology，The Fourth Affiliated Hospital of the Medical College of Jinan Uiversity/Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220

Objective To observe the expression difference of myeloid differentiation factor 88（MyD88）protein in hepatic stellate cell（HSC）treated with curcumin，and to investigate the related mechanism of the anti-fibrotic effect of curcumin.Methods 293T cell and HSC cell were individually divided into control group，vector of MyD88 plasmid group，and curcumin+vectors of MyD88 plasmid group.The expression of MyD88 was detected by Western blot.Results①After transfection of pCMV-Myc-MyD88，the expression of MyD88 was significantly increased（P＜0.05），while the expression of MyD88 in curcumin+vectors of MyD88 plasmid group was significantly decreased than vectors of MyD88 plasmid group（P＜0.05）.②After transfection of pCMV-Myc-MyD88 HSC，the expression of MyD88 was significantly increased（P＜0.05）.The expression of MyD88 in curcumin+vectors of MyD88 plasmid group was significantly decreased compared with vectors of MyD88 plasmid group（P＜0.05）.Conclusions Curcumin might prevent liver fibrosis by inhabiting the expression of MyD88 protein and blocking MyD88-dependent signaling pathway.

MyD88；Curcumin；Hepatic stellate cells

2014-11-24）

（本文编辑：白岚）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.007

1 517000广东省河源市中医院；2 510220暨南大学医学院附属第四医院/广州市红十字会医院

舒建昌，E-mail：shujc62@hotmail.com

广东省科技计划项目（20120318023），广东省科技计划项目（2020314），中国肝炎防治基金会王宝恩肝纤维化研究基金项目（CFHPC20131014）