孙 乾，王金春，孙 锋

桂芍知母汤对类风湿关节炎模型鼠滑膜组织血管内皮生长因子的影响

孙 乾，王金春，孙 锋

目的 观察桂芍知母汤对胶原诱导类风湿关节炎(CIA)模型鼠血管内皮生长因子(VEGF)的影响，探讨其作用靶点。方法 将40只健康雌性大鼠随机分为正常组、模型组、来氟米特组、桂芍知母汤组，除正常组之外,其余各组使用Ⅱ型胶原诱导大鼠造成CIA模型。桂芍知母汤组、来氟米特组，造模后开始给药,共计30 d。按评分法评价关节炎指数,ELISA法检测VEGF表达。结果 给药组较模型组关节发病数目减少，关节肿胀程度减轻，皮肤红肿不明显，关节变形程度减轻。给药组与模型组在关节炎指数方面比较有明显差异(P<0.05)。给药组CIA大鼠踝关节滑膜组织升高的VEGF水平显著降低(P<0.01)。结论 桂芍知母汤组与模型组比较,关节炎指数明显降低,大鼠踝关节滑膜组织VEGF水平明显下降。

桂芍知母汤；类风湿关节炎；血管内皮生长因子

0 引言

类风湿关节炎(RA)可导致滑膜和关节软骨损伤,进而出现骨破坏,使患者关节畸形、功能障碍。治疗的关键在于阻止骨破坏及改善局部症状。西药在治疗本病时，明确提出控制病情及改善症状。中药在治疗RA 时，是否有类激素样作用，或者通过阻止骨破坏起到控制病情的作用目前尚无系统研究。本研究从一般形态学、分子生物学方面观察了经方桂芍知母汤抑制类风湿关节炎骨破坏的生物学效应，为临床治疗此病正确选择用药提供充分的证据，为中医经方的科学应用提供有力的支撑。

1 资料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 普通级健康雌性大鼠40只，体重(146±20)g，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。

1.1.2 实验药品及制备 方用桂芍知母汤[1]：桂枝12 g、白芍药9 g、甘草6 g、麻黄6 g、生姜15 g、白术15 g、知母12 g、防风12 g、炮附子9 g购自辽宁中医药大学附属医院，在辽宁中医药大学实验室煎煮。对照组用药：来氟米特片[2](苏州长征欣凯制药有限公司，批号：110221)。

1.1.3 主要试剂 弗氏完全佐剂：购自北京欣惠泽奥科技有限公司，批号：049k8700。血管内皮生长因子试剂盒：美国Initorgenv公司。

1.1.4 主要仪器及设备 电子天平：瑞士precisa，型号：xs-225A；低速台式离心机：北京医用离心机厂，型号：LD4-ZA；荧光显微镜：日本奥林巴斯，型号：BX51TRF；全自动酶标仪：奥地利Anthosl，型号：17550；以上均由辽宁中医药大学分子生物学实验室提供。

1.1.5 实验室 整个实验均安排在辽宁中医药大学清洁级实验室中实施。本课题涉及实验室-分子生物学实验室系国家中医药管理局局级科研三级实验室(2002年批准)。

1.2 实验方法与结果

1.2.1 实验动物分组 选择雌性健康大鼠40只，体重(146±20)g，鼠龄4～5周。随机选10只为正常鼠，另外30只建立Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA大鼠模型[3]。后者随机分成：模型组、来氟米特组、桂芍知母汤组，10只为一组。正常组大鼠每只左后足跖皮内注射生理盐水100 μL。

1.2.2 模型制备 随机取10只为正常组，另外30只建立Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠RA模型,将酸溶性胶原蛋白[collagen(Ⅱ)]用弗氏完全佐剂配成CⅡ浓度为2.5 mg/mL的乳剂,在每只大鼠左后足跖皮内注射100 μL乳剂(含CⅡ250 μg)。

1.2.3 处理因素 ①模型组：造模后10 d开始给予生理盐水2 mL/(只·d)灌胃。②其他组:造模后10 d,按照鼠-人的折算剂量分别以不同药物灌胃,1次/d。③正常组:不做任何处理。

1.2.4 取材 以上各组大鼠治疗30 d后，先做一般形态学观察，取双侧踝关节,放置在含多聚甲醛和焦碳酸二乙酯(DEPC)的固定液中固定备用。

1.2.5 指标检测 大鼠足跖的外观：观测其肿胀程度，计算出关节炎指数。关节炎指数计算：观察并记录全身关节病变程度，关节病变按4级评分法评价，根据四肢各肢体的病变程度累计积分，计算出关节炎指数。0分：无红肿;1分：1个趾关节红肿；2分：2个趾关节红肿；3分：3个及以上趾关节和跖足肿胀。各个关节的积分累计，即为每只小鼠的关节炎指数，最大值为12。治疗前，模型组、来氟米特组、桂芍知母汤组关节炎指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠踝关节滑膜组织血管内皮生长因子[4]检测：ELISA法检测滑膜VEGF的水平,严格按试剂盒说明书进行。

1.3 数据统计 所有实验数据应用SPSS 17.0统计软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般形态学考察 桂芍知母汤组及来氟米特组较模型组关节发病关节肿胀及关节变形程度明显减轻，关节变形数目明显减少,桂芍知母汤组及来氟米特组与模型组关节炎指数均大幅度下降。见表1。

表1 各组模型大鼠关节炎指数比较

注：与模型组比较,*P<0.05

2.2 ELISA法检测结果 CIA造模后治疗30 d，经ELISA法检测：模型组大鼠踝关节肿胀明显，大鼠滑膜组织VEGF水平明显升高，桂芍知母汤及来氟米特组与模型组比较关节肿胀明显减轻，大鼠滑膜组织VEGF水平明显下降。与正常组比较,模型组大鼠滑膜组织VEGF水平明显升高(P<0.01),桂芍知母汤组及来氟米特组均能明显降低大鼠滑膜组织升高的VEGF水平(P<0.01),桂芍知母汤组与来氟米特组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组模型大鼠滑膜组织VEGF水平的比较

注：与模型组比较,*P<0.01

3 讨论

RA是一种慢性侵袭性关节炎性疾病，若得不到有效治疗，会导致患者的关节功能丧失，进而造成患者生活自理能力及劳动能力的丧失，给社会及家庭造成严重的心理及经济负担，是我国人群丧失劳动力和致残的主要疾病之一。因此，延缓甚至阻断骨质破坏成为RA治疗的重要目标之一。滑膜炎是引起软骨破坏[5]和骨侵蚀[6]继而引起关节强直、畸形、功能丧失的重要标志。

RA的滑膜病变表现为滑膜组织的异常增生,血管翳形成,甚至严重影响关节周围组织,具有类肿瘤样生长的特点。上述特点与本实验模型组大鼠踝关节病理变化相符合。许多生长因子和大量炎性因子参与此病理过程,VEGF是滑膜炎症发展及滑膜血管翳形成的十分重要的炎性因子之一。VEGF的分子量约为46 kD，其性质是高度糖基化的碱性蛋白,同时也是内皮细胞的特异性有丝分裂原。VEGF直接通过滑膜细胞、血管内皮细胞及浸润的单核巨噬细胞等起作用,是一种强有力的促血管生成因子，其主要靶细胞是血管内皮细胞,通过增加血管内皮细胞的有丝分裂,促进新生血管形成,VEGF广泛存在于RA的滑膜和滑膜液中。有实验证明，血管平滑肌细胞、梭样衬里内层细胞、巨噬样滑膜衬里细胞均有VEGF表达。近年来的研究又发现，RA的关节软骨细胞、肥大细胞、淋巴细胞均有丰富的VEGF表达，滑膜液的成纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞可以分泌VEGF。Dufe等[7]发现，VEGF在滑膜和滑膜表面表达显著。在邻近区发现121酪氨酸激酶1表达VEGF，可以解释fms酪氨酸激酶Ⅰ在滑膜表面附近的血管上出现；DeBandt等[8]研究发现，接近人类关节炎造模鼠关节滑膜细胞能够表达VEGF、含激酶插入功能区受体、121样酪氨酸激酶1胎肝激酶1。RA的病理性新生血管形成过程中有多种血管新生相关因子参与。有研究表明，VEGF与内皮抑制素失衡是RA血管新生的罪魁祸首[9]。其作用机制为：VEGF等促血管生成因子与内皮抑制素[10]等抑制血管生成因子之间失衡,导致细胞凋亡抵抗性升高，从而使多种调节因子诱导VEGF持续高水平表达，VEGF与其受体结合，启动信号转导通路，导致血管周围细胞外基质的异常降解、内皮细胞的迁移和异常增殖、毛细血管的分化和吻合，进一步形成新生血管。VEGF在RA整个病理性新生血管形成过程中起着不可或缺的作用。

长期以来，中药对RA的治疗优势已被业内人士所公认，但缺乏中药对RA的作用靶点及作用机制系统深入的研究。本实验观察了桂芍知母汤对RA大鼠关节炎发展的影响,实验结果显示，经桂芍知母汤治疗后,CIA大鼠关节炎指数明显降低，损伤程度明显减轻,表明桂芍知母汤具有良好的抗炎、抑制骨破坏的作用。同时实验进一步观察了桂芍知母汤治疗RA大鼠的作用机制,结果发现,经桂芍知母汤治疗后,RA大鼠滑膜组织VEGF水平明显下降，表明桂芍知母汤是通过抑制VEGF的生成而起到对CIA大鼠抗炎、抑制骨破坏的作用。

[1] 李宇铭,姜良铎.桂枝附子汤与甘草附子汤释义[J].山东中医药大学学报,2011,35(3):210-212.

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[5] 葛琳,梁军,张华东.类风湿关节炎继发骨质疏松症病机探析[J].中华中医药杂志,2011,26(1):100-102.

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Influence of Guishao Zhimu decoction on vascular endothelial growth factor in sliding membrane tissue of rheumatoid arthritis model rats

SUN Qian,WANG Jin-chun,SUN Feng

(Department of Rheumatology and Immunology,Shenyang Fifth People Hospital,Shenyang 110023,China)

Objective To observe the influence of Guishao Zhimu decoction on vascular endothelial growth factor(VEGF) in rheumatoid arthritis(CIA) model of mice induced by collagen,and discuss the acting targets.Methods 40 healthy female rats were randomly divided into normal group,model group,fluorine mitt group and Guishao Zhimu decoction group.All groups were induced by using Ⅱ type collagen to form the CIA model in rats except the normal group.The arthritis index was evaluated by using score method,vascular endothelial growth factor (VEGF)expression was evaluated by using ELISA method in Guishao Zhimu decoction group and fluorine mitt group after 30 d of treatment.Results Compared with model group,the numbers of joint disease reduced,the degree of joint swelling relieved,skin irritation disappeared,the degree of joint deformation alleviated in the medication group.There was significant difference in arthritis index between the medication groups and model group(P<0.05).The increased levels of VEGF in ankle synovial tissue of rheumatoid arthritis significantly reduced in medication group(P<0.01).Conclusion Compared with model group,the arthritis index and ankle synovial tissue VEGF levels of rats in Guishao Zhimu decoction group significantly decreased.

Guishao Zhimu decoction;Rheumatoid arthritis;Vascular endothelial growth factor

2014-06-28

沈阳市第五人民医院风湿免疫科，沈阳 110023

10.14053/j.cnki.ppcr.201503002