彭 扬，霍翠翠，闫 芳，吕 静，白 雪，李 慧

辛伐他汀对新诊断2型糖尿病患者单核巨噬细胞胆固醇外流的影响

彭 扬*，霍翠翠，闫 芳，吕 静，白 雪，李 慧

目的 研究新诊断2型糖尿病患者外周血单核巨噬细胞SR-B1、ABCA1表达及胆固醇外流的变化，以及辛伐他汀治疗对上述指标的影响。方法 采用Western 印迹法及RT-PCR方法检测新诊断糖尿病患者(A1、B1组)、正常对照组(C组)及辛伐他汀治疗后(A2、B2组)外周血单核巨噬细胞SR-B1、ABCA1蛋白及mRNA表达、胆固醇外流率。结果 新诊断糖尿病患者单核巨噬细胞SR-B1 蛋白及mRNA表达各组间以及治疗前后比较差异无统计学意义(P>0.05)。ABCA1 蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.05)，辛伐他汀治疗后B2组升高明显(P<0.05)，但仍显著低于C组(P<0.05)。两个糖尿病组胆固醇外流率明显下降(P<0.05)，A1、B1两组间差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后的A2组胆固醇外流率轻度升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，B2组胆固醇外流率显著升高(P<0.05)，但未达到C组水平(P<0.05)。巨噬细胞胆固醇外流率与ABCA1蛋白及mRNA表达密切相关(r1=0.752，r2=0.724，P<0.05)。结论 新诊断2型糖尿病患者的外周血单核巨噬细胞胆固醇外流率较正常对照组明显下降，这种变化可能与转运体ABCA1表达下降有关。辛伐他汀治疗可能通过部分提高ABCA1表达从而增加胆固醇外流而起到抗动脉粥样硬化作用。

胆固醇外流；SR-B1；ABCA1；辛伐他汀

0 引言

动脉粥样硬化性心血管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)包括冠心病、动脉粥样硬化性卒中和外周血管疾病，是目前发病率及死亡率非常高的疾病[1]。高血糖人群ASCVD发病率明显升高，2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)患者危险性升高2～4倍，即使在血糖轻度升高的葡萄糖耐量异常人群也是如此[2]。高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)通过转运动脉巨噬细胞多余的胆固醇从细胞内流出-胆固醇逆转运来预防ASCVD[3]。其中B类1型清道夫受体(Scavenger receptor class B，type 1,SR-B1)是HDL的受体，三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)是该过程中的胆固醇转运体，二者均在介导胆固醇逆转运中起重要作用[4]。本研究旨在通过新诊断T2DM患者外周血单核巨噬细胞SR-B1及ABCA1表达、胆固醇外流的变化以及辛伐他汀治疗对上述指标的影响，从而进一步探讨糖尿病患者动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的发生机制及他汀类药物在糖尿病动脉粥样硬化中的作用。

1 方法

1.1 研究对象 按1999 年WHO 糖尿病诊断标准,收集2012年3-12月在我院体检新诊断的2 型糖尿病患者。将其随机分为常规治疗组(A1组)和辛伐他汀治疗组(B1组)，体检健康非糖尿病组(C组)。排除标准包括拒绝参加者，不能随访者，血液动力学改变者，高血压，糖尿病微血管并发症，血清三酰甘油(TG)≥5 mmol/L，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)≥3.37 mmol/L，严重的肝肾疾病、肺部疾病、肿瘤、自身免疫性疾病及各种感染性疾病。研究方案经医院伦理委员会批准，所有受试者均知情同意。

1.2 方法 对所有受试者询问病史，年龄，测量血压及身高、体重、腰围等人体参数。受试对象正常饮食3 d，空腹12 h后采集外周静脉血40 mL,常规方法测定空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、TG、LDL-C及HDL-C；其余35 mL抗凝血用于分离外周血单个核细胞，进行下一步试验。所有入选人员均同样接受饮食指导，运动指导；A1、B1组在此基础上根据治疗指南选择合适的口服降糖药物并逐渐调整剂量，B1组受试者额外每日睡前口服辛伐他汀40 mg，每月监测一次肝功能(肝功能异常者停止试验)，24周后重新采血测定上述各项指标，具体分组方案见图1。

图1 研究方案分组图解

1.2.1 材料 辛伐他汀为杭州默沙东制药公司产品；人淋巴细胞分离液(天津灏洋)；兔抗人SR-BI多克隆抗体(美国Novus)；兔抗人ABCA1多克隆抗体 (武汉博士德公司)；油红 O、[3H]胆固醇 (Sigma公司 )，PCR引物(北京奥科)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)。其他试剂为国产分析纯。

1.2.2 人外周血单核细胞分离与培养 取受试者外周静脉血，应用PBS 1∶1稀释后，细胞悬液加在与血液等量的淋巴细胞分离液(d=1.077)上，1 500 r/min离心20 min。收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，洗涤2次。用含10 %胎牛血清(Fetal calf serum，FCS) 的 1 640 培养液重悬细胞，细胞计数后均匀接种于培养瓶中，置37 ℃、5%CO2培养箱培养4 h后弃掉培养基，用37 ℃预热的培养基清洗3遍，将未贴壁细胞洗脱。剩下的单核细胞予以10%自身血清+10 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)+RPMI 1 640培养72 h使细胞巨噬化，油红O染色及CD68免疫组化染色鉴定巨噬细胞。

1.2.3 Western 印迹法 将培养后的细胞用PBS洗2次，加入细胞膜裂解液，冰浴超声粉碎细胞，离心15 min(4 ℃,12 000×g)，取上清液测定细胞溶解物中蛋白含量，取相同量蛋白(50 μg)进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转移至硝酸纤维素膜上。用5%脱脂奶粉PBS-T液室温封闭1 h，加入一抗：SR-B1抗体(1∶800)；ABCA1抗体(1∶150稀释)4 ℃孕育过夜，将膜洗涤3次后再置于1∶500稀释的山羊抗兔二抗中室温作用2h，相同方式洗涤后用ECL方法显色，X-片感光，洗片。蛋白条带经扫描后进行灰度值分析。

1.2.4 RT-PCR检测 根据文献设计引物，人SR-BI上游引物：5′ -TGA CCG GGT GGA TGT CCA GGA AC -3′,下游引物：5′ -TGA TGATGG AGA ATA AGC CCA T -3′,扩增片段 696 bp；ABCA1上游引物：5′- ACA ACC AAA CCT CAC ACTACT G-3′,下游引物：5′ - ATA GAT CCC ATT ACA GAC AAC G-3′,扩增片段439 bp；GAPDH上游引物：5′ -TGA ACG GGA AGC TCG CTG G-3′,下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′,扩增片段307 bp。用Trizol提取细胞总RNA后，用RT-PCR检测mRNA表达，PCR总反应体系25 μL。SR-BI PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，在95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min条件下循环35次；ABCA1 PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，在94 ℃ 1 min，61 ℃30 s，72 ℃ 1 min条件下循环38次；GAPDH PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，在94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min条件下循环30次，最后72 ℃终止5 min。PCR产物以1.5 %琼脂糖凝胶电泳观察、扫描，以同管GAPDH为内参照，进行比值半定量分析。

1.2.5 胆固醇外流率检测 单核细胞培养72 h,待细胞巨噬化后,将细胞接种于 24 孔板，每孔 2.0×104个细胞，每组设2个复孔。加入3.7×104Bq/mL的[3H]胆固醇孵育液,37 ℃孵育24 h后弃去并清洗细胞。以5 %自身血清诱导胆固醇外流,诱导完成后收集液体，离心取上清为细胞外流液。细胞清洗后加入 0.5% Triton-X100，振荡 1 h 后收集细胞裂解液。分别将两种液体与闪烁液混合，充分混匀后液闪计数。分别测量上清液及细胞裂解液中[3H]含量，并计算外流率:胆固醇外流率 = 细胞外流液[3H]/ ( 细胞外流液[3H]+细胞裂解液[3H])×100%。

2 结果

2.1 受试者的基线临床特点及用药前后变化 完成受试者共34名，其基本资料及临床指标见表1、表2。

表1 受试者的基本资料

表2 各组临床指标比较(mmol/L)

注：*与C组比较，P<0.05；▲与治疗前(A1/B1)比较，P<0.05；#与A2组比较,P<0.05

由表1、表2可见，A、B、C组在入组时比较，除FBG、HbA1c及TG外，其余各项指标(包括LDL-C)比较差异均无统计学意义，即三组基本资料具有可比性。治疗结束时糖尿病组FBG、HbA1c、TG均明显下降(P<0.05)；其余指标差异无统计学意义；辛伐他汀治疗后的B2组除上述指标变化外，TC及LDL-C也下降(P<0.05)，LDL-C低于C组(P<0.05)。

2.2 SR-B1和ABCA1的蛋白及mRNA表达 Western 印迹法分析SR-B1及ABCA1蛋白表达见图2和图3。SR-B1蛋白无论在治疗前还是治疗后，组间及组内比较差异均无统计学意义(P>0.05)。而ABCA1蛋白表达在A1组和B1组较C组明显下降(P<0.05)，A1、B1两组间ABCA1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。B2组ABCA1蛋白表达较B1组升高，但仍明显低于C组(P<0.05)。

SR-B1和ABCA1 mRNA与蛋白变化趋势一致，即SR-B1 mRNA无论组间还是治疗前后均无明显变化，而ABCA1 mRNA在初期A1、B1组较C组明显下降(P<0.05)，治疗后的B2组升高明显(P<0.05)，但仍低于C组(P<0.05)，见表3。

表3 各组SR-B1和ABCA1mRNA相对表达量

注：*与C组比较，P<0.05；▲与B1组比较，P<0.05；#与A2组比较，P<0.05

图2 Western 印迹法分析SR-B1及ABCA1蛋白表达

图3 各组SR-B1及ABCA1蛋白表达对比

2.3 胆固醇外流率的变化及与SR-B1和ABCA1的相关性分析 治疗前三组间比较，巨噬细胞胆固醇外流率在A1组和B1组明显下降(P<0.05)，A1、B1两组间差异无统计学意义(P>0.05)。组内前后比较，A2组胆固醇外流率较A1组轻度升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，B2组胆固醇外流率较B1组显著升高(P<0.05)，但仍明显低于C组(P<0.05)，见图4。

图4 各组巨噬细胞胆固醇外流率比较

相关性研究发现，受试者巨噬细胞胆固醇外流率与ABCA1的蛋白及mRNA表达水平均呈正相关，相关系数分别为r1=0.752和r2=0.724(P<0.05)。与SR-B1的蛋白及mRNA表达水平之间未发现有统计学意义的相关性(P>0.05)。

3 讨论

AS病变早期的细胞病理学改变是单核巨噬细胞吞噬大量脂质形成泡沫细胞[5]，而胆固醇由巨噬泡沫细胞血管壁流出是胆固醇逆转运过程的首要步骤，有利于维持细胞内胆固醇的稳态，在预防脂质在血管壁的沉积及AS的进展发挥了极其重要的作用[6]。

糖尿病以高血糖为主要特征，但即使严格控制血糖至正常水平，糖尿病ASCVD发生率及死亡率仍然未下降[7]。这说明血糖水平并非是影响糖尿病ASCVD的主要原因。多项研究发现，T2DM患者经常伴随HDL-C降低，而且HDL-C的数量也不能完全反映其功能，外周细胞胆固醇外流率是直接反映HDL功能的重要指标之一[3]。HDL的受体SR-B1及转运体ABCA1均被证实可以介导胆固醇外流。本研究以新诊断的T2DM患者为研究对象，以外周血单核巨噬细胞SR-B1与ABCA1表达及胆固醇外流变化来说明T2DM对AS的影响。研究发现，新诊断糖尿病患者外周血单核巨噬细胞SR-B1表达与非糖尿病者差异无统计学意义，而ABCA1表达明显下降，无论从蛋白水平还是mRNA水平均得出相似的结论，这与多项研究结果相一致[2,8-9]。但也有研究未发现糖尿病患者ABCA1表达的变化[10]，分析原因考虑可能与研究对象的基础状态不同有关。从胆固醇外流率变化来看，糖尿病患者较非糖尿病者巨噬细胞胆固醇外流率明显下降，且与ABCA1表达密切相关。从该结果分析新诊断糖尿病患者外周血单核巨噬细胞胆固醇外流率下降可能是致AS的原因之一，而且这一过程可能是通过转运体ABCA1表达下降而不是SR-B1变化实现的。

他汀类药物可以通过多种机制发挥抗AS作用[11-12]，在糖尿病ASCVD预防及治疗方面他汀类药物起到了重要的作用[13-14]。本研究通过对新诊断糖尿病患者应用辛伐他汀治疗前后检测上述指标发现，患者外周血单核细胞SR-B1蛋白及mRNA表达无明显改变，而ABCA1蛋白及mRNA表达显著升高，同时患者外周血单核巨噬细胞胆固醇外流率明显升高。而在非他汀治疗的A组差异无统计学意义，这说明辛伐他汀可以部分上调巨噬细胞ABCA1蛋白及mRNA，并改善其胆固醇外流率。然而，从B2组治疗后胆固醇外流率仍低于C组可以看出，辛伐他汀治疗尚不能完全逆转糖尿病患者巨噬细胞胆固醇外流率，即使LDL-C明显下降，甚至低于正常对照组。这也说明单纯应用该类药物，只能部分逆转但不能完全阻止AS的发生发展。

他汀类药物可以逆转AS作用近期已经形成专家共识[15]，但对于糖尿病患者应用该类药物仍然要考虑到其安全性问题，近年也有研究发现，他汀类药物可能影响葡萄糖代谢[16]，另外，目前通过评估发现，他汀治疗导致新发糖尿病风险增加9%[17]，因此在应用他汀类药物时，更需要遵循个体化的原则，以保证患者用药安全。总之，本研究发现，新诊断T2DM患者外周血单核巨噬细胞ABCA1表达，及胆固醇外流率明显下降，这可能是糖尿病致AS的原因之一。辛伐他汀治疗后二者均显著升高，且密切相关，说明辛伐他汀治疗可能通过部分提高ABCA1表达，从而增加胆固醇外流而起到抗AS作用。

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Effect of simvastatin on cholesterol efflux from macrophages of patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus

PENG Yang*,HUO Cui-cui，YAN Fang，LÜ Jing，BAI Xue,LI Hui

(Department of Geriatrics，Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004，China)

Objective To learn the effects of diabetes status and simvastatin on cholesterol efflux from human peripheral blood monocytes(PBMC)-derived macrophages,as well as the expression of scavenger receptor B1(SR-B1)and ATP-binding cassette receptor A1(ABCA1).Methods Blood was collected from subjects with newly diagnosed type 2 diabetes(T2DM: Group A1 and B1)and controls(Group C).Peripheral blood monocytes were differentiated for 72 h into macrophages.The expression of SR-B1 and ABCA1 protein and mRNA were detected by Western blot and RT-PCR,respectively.Cholesterol efflux assays were performed at the same time.The experiments were repeated after twenty-four weeks simvastatin treatment(Group A2-A1 without simvastatin; Group B2-B1 with simvastatin).Results The expression of SR-B1 mRNA and protein was not significantly different among three groups,as well as that of simvastatin treatment(P>0.05).In contrast,the expression of ABCA1 in macrophages from patients with T2DM significantly reduced(P<0.05).After twenty-four weeks simvastatin treatment,it was still lower than that of controls(P<0.05),although it was upreglulated significantly(P<0.05).In addition,cellular cholesterol efflux from macrophages to autologous serum significantly reduced in group A1 and B1,compared with group C(P<0.05).In group A2,there was a slightly increase in macrophages cholesterol efflux,which was not significantly different compared with that in group A1(P<0.05).Nevertheless,cholesterol efflux in group B2 ascended significantly compared with that in group B1(P<0.05).The change of macrophage cholesterol efflux correlated with the expression of ABCA1 significantly(r1=0.752，r2=0.724，P<0.05).Conclusion Cholesterol efflux reduced in macrophages of new diagnosis T2DM,which may be correlated with down regulating of ABCA1.Simvastatin may plays a protective role through improving cholesterol efflux and upregulating ABCA1 expression.

Cholesterol efflux; SR-B1; ABCA1; Simvastatin

2014-11-01

中国医科大学附属盛京医院老年病科，沈阳 110004

辽宁省科技计划项目(2011225020)

10.14053/j.cnki.ppcr.201503004

*通信作者