李佳茵，王慧敏，祖国仁

（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034）

一株产壳聚糖酶海洋真菌MF-08的分离鉴定及酶学性质研究

李佳茵，王慧敏，祖国仁*

（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034）

从实验室保存的海洋产壳聚糖酶真菌中分离纯化出一株产壳聚糖酶活性较高的菌株，命名为MF-08。通过26S rDNA序列分析并结合形态学鉴定，将海洋真菌MF-08归为黄曲霉群。壳聚糖酶的最适作用温度为40℃；最适反应pH为5.2；酶活在pH4.0～6.0和小于40℃范围内相对稳定；Cu2＋、Fe3＋和Hg2＋对壳聚糖酶活性有明显的抑制作用。

海洋真菌MF-08，壳聚糖酶，26S rDNA

壳聚糖是甲壳素脱乙酰后的产物，是自然界中唯一天然存在的阳离子聚合物[1]。壳寡糖是壳聚糖的降解产物，是目前仅知的唯一的碱性寡糖，具有独特的生物活性。由于壳寡糖与生物体细胞具有良好的生物兼容性，无毒性、环境友好型、易被生物体分解等许多特殊的理化性质，被广泛地应用于多个领域。尤其是在医药和食品方面，壳寡糖具有提高食品质量和人体健康的重要功效。制备壳寡糖的方式主要有物理降解法、化学降解法和生物降解法（主要指酶法降解）[2]。壳聚糖酶是水解壳聚糖制备壳寡糖的专一性水解酶之一[3]。酶法降解易于控制过程和产物质量分布，且不造成环境的污染。为微生物工业化转化壳聚糖提供理论基础和实验依据。目前已从多种微生物中分离出壳聚糖酶，大部分以细菌为出发菌，而且酶活相对并不是很高，壳聚糖酶实现商业化发展就比较困难。以从海洋中筛选分离出来的真菌为出发菌株的报道不是很多，提高其产壳聚糖酶的酶活性，为开发海洋资源提供重要依据。

本实验研究一株从实验室保存的海洋产壳聚糖酶真菌中分离纯化出的产壳聚糖酶活性较高的菌株。通过形态学观察及26S rDNA序列进行了初步鉴定。并对其产酶特性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海洋真菌MF-08 大连工业大学微生物实验室分离保藏。

不锈钢手提式蒸汽灭菌锅 上海博讯仪器厂；DK-S24型电热恒温水浴锅、DGG-9070B型电热恒温鼓风干燥箱、MJP-150型霉菌培养箱 上海森信实验仪器有限公司；双层小容量全温度恒温振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；722s分光光度计 上海精密仪器科学有限公司；TGL-16C型台式离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 培养基

试管斜面培养基：1.0%葡萄糖，0.5%壳聚糖，0.2%蛋白胨，0.1%酵母膏，40%蒸馏水，60%陈海水，2%琼脂，115～120℃，灭菌20 min，冷却待用。

发酵培养基：碳源1.0%；酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%；FePO40.01%；陈海水100 mL；pH7.6；在115～121℃灭菌20 min，冷却待用。

平板分离培养基：1.0%胶体壳聚糖，0.5%蛋白胨，0.1%酵母膏，2%琼脂，100 mL陈海水，115～120℃，灭菌20 min，冷却待用。

改良的PDA培养基：将马铃薯洗净，去皮，切成2 cm2的小块备用。取20 g放入烧杯中，加入100 mL陈海水，煮沸30 min，用玻璃棒搅拌以防糊底。用双层纱布过滤，取其滤液，补足海水，加入0.5%壳聚糖和1%蔗糖，在115～121℃灭菌20 min，冷却待用。

1.3 实验方法

1.3.1 粗酶液的制备 从保藏的试管斜面挑取孢子于液体发酵培养基中，37℃，振荡培养72 h，取一定量发酵液，8000 r/min离心15 min，其上清液即为粗酶液[3]。

1.3.2 酶活力测定方法 1 mL含壳聚糖0.5%（0.5 g/100 mL）的乙酸缓冲液，加入1 mL粗酶液，37℃下保温30 min，煮沸5 min终止酶反应[4]。DNS法测定还原糖[5]。

酶活性（U/mL）＝m×N×1000/（M×T×V）

其中：m：还原糖量（mg）；N：稀释倍数；M：还原糖分子量（氨基葡萄糖C6H13O5N分子量）；T：反应时间（30 min）；V：酶液体积（1 mL）。

相对酶活：以同组实验的最高酶活性值为1，其他酶活性与最高酶活的比值。

剩余酶活（%）：经过一定处理后此时的酶活/原来的酶活。

1.3.3 产壳聚糖酶菌株的分离纯化 对本实验室冷藏保存的20支菌种分别进行平板梯度稀释，于27℃恒温培养120 h，挑选生长情况较好的、有明显透明圈的菌株。用平板分离培养基分离得到的活性较高的菌株，摇瓶发酵，用DNS法测酶活力，选取一株酶活力最高的菌株作为出发菌株[5]。将筛选出的菌株接入试管斜面培养基，冷藏保存。

1.3.4 海洋真菌MF-08的形态学鉴定 三点培养——菌落形态观察：用灭菌牙签沾取少量孢子在平板分离培养基上呈等边三角形的点三个点，倒置于27℃的霉菌培养箱内，培养一定时间，观察其逐渐变化。

小室培养——个体形态观察：挑取少量海洋真菌MF-08的孢子于有马铃薯葡萄糖培养基的载玻片上，置于27℃霉菌培养箱中培养，24 h后于显微镜下观察。

大培养——个体形态观察：将生长有菌落的培养皿去除皿盖置于显微镜的载物台上，用低倍镜观察其生长情况。

制片观察——菌落形态观察：在干净的载玻片上加一滴乳酸-苯酚固定液，用三棱针挑取已培养好的菌株MF-08置于其中，40倍光学显微镜下观察[6]。

根据霉菌菌落及个体形态观察，鉴定出霉菌菌属。根据霉菌形态基本鉴定方法结合《食品卫生微生物检验标准手册》[7]鉴定出霉菌菌种。

1.3.5 26S rDNA扩增与序列分析 26S rDNA的D1/D2区序列扩增的通用引物NL1：5’-GCATATCAATAAG CGGAGGAAAAG-3’；NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAA GACGG-3’进行扩增，PCR反应体系为50 μL：上述1的变形反应液1μL，PCR Premix 25μL，D1/D2 Forward primer（20pmol/μL）0.5 μL，D1/D2 Reverse primer（20pmol/μL）0.5 μL，dH2O 23μL。PCR过程：94℃，5 min；（94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min）×30个循环；72℃，5 min。PCR产物进行检测回收，并送交测序公司测序。

1.3.6 系统发育树的构建 将所得序列与NCBI数据库中的序列进行Blast比对，采用Mega 3.1软件的邻接法构建该海洋真菌的系统发育树。

1.3.7 酶学性质的研究方法

1.3.7.1 最适反应温度 将酶促反应体系的温度分别设定为30、35、40、45、50、55、60、70、80℃，按照1.3.2的方法测酶活。

1.3.7.2 壳聚糖酶温度稳定性 将壳聚糖酶的粗酶液分别置于30、40、45、50、60℃恒温水浴锅中保温10、20、30、40、80、120 min，然后按照1.3.2的方法测剩余酶活力。

1.3.7.3 最适反应pH 用pH分别为4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6和5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液和0.5%壳聚糖底物溶液代替酶活力测定中的pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液和0.5%壳聚糖底物溶液，按照1.3.2的方法测酶活。

1.3.7.4 壳聚糖酶pH稳定性 将粗酶液与不同pH的广泛缓冲以1∶1体积比混合，在4℃下放置6 h，测剩余酶活。

1.3.7.5 金属离子对壳聚糖酶活性的影响 分别向粗酶液加入5 mmol/mL Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋、Cu2＋、Zn2＋和Cu2＋，4℃静置10 min后，测酶活。以不加金属离子的酶液的酶活为参照。

1.3.8 方差分析数据处理方法 利用SPSS软件对数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 产壳聚糖酶菌株的分离纯化

将本实验室保藏的海洋产真菌按照1.3.3中所述的方法进行分离纯化，从中选取生长速度较快，酶活力最高是一株海洋真菌MF-08作为实验的出发菌株。如图1为海洋真菌MF-08在平板分离培养基上生长产生的菌落透明圈形态照片。

图1 菌株的菌落和透明圈Fig.1 Strain colony with transparent cricle

2.2 海洋真菌MF-08的鉴定

2.2.1 海洋真菌MF-08的菌落形态观察 用三点培养法将海洋真菌MF-08用灭菌牙签接于平板分离培养基上，观察其菌落形态变化见图2。

图2 MF-08的菌落形态Fig.2 The colony morph of MF-08 on plate

由图2可知，菌落呈圆形酥松放射状，扁平完整，无浸出液，无光泽。实验发现颜色变化为：白点→变黄→变绿。

2.2.2 海洋真菌MF-08的个体形态观察

2.2.2.1 小室培养 根据1.3.4中小室培养的方法进行培养并观察，结果见图3。

图3 海洋霉菌N-8小室培养镜下形态Fig.3 Microscopic morph of marine mold N-8 in cell culture inserts

2.2.2.2 制片观察 根据1.3.4中制片观察的方法进行培养并观察，结果见图4。

图4 海洋霉菌N-8制片观察镜下形态Fig.5 Microscopic morph of marine mold N-8 on slide glass

2.2.2.3 大培养 根据1.3.4中大培养的方法进行培养并观察，结果见图5。

图5 海洋霉菌N-8大培养镜下形态Fig.5 Microscopic morph of marine mold N-8 on plate culture

2.2.3 海洋真菌MF-08的形态学鉴定 经过以上实验，参照《食品卫生微生物检验标准手册》[7]曲霉菌属检测表，发现分生孢子头在发育过程中出现一些绿色，顶囊不是棒形，小梗单层或两层。分生孢子头幼期呈现鲜明的黄、绿色，有时老后变成褐色，酥松放射状，全部顶囊着生小梗，小梗双层。所以初步鉴定为海洋真菌MF-08群。

2.2.4 26S rDNA扩增与序列分析 菌株MF-08的PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图6。

图6 海洋真菌MF-08的26S rDNA 3%琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.6 3%agarose gel electrophoresis analysis of 26S rDNA

扩增产物片段的大小为594 bp，将所得序列与NCBI数据库中的序列进行Blast（Basic Local Alignment Search Tool）比对，结果发现该海洋真菌MF-08的26S rDNA部分序列与曲霉属（Aspergillus sp.）的26S rDNA序列同源性达100%，由此可知，该海洋产壳聚糖酶真菌为曲霉属。

2.2.5 系统发育树的构建 采用Mega 3.1软件的邻接法构建海洋真菌MF-08的系统发育树，见图7。

如图7可知，海洋真菌MF-08与Aspergillus flavus（EF661564.1）和Aspergillus flavus（EF661566.1）聚在一起。故海洋真菌FM-08属于黄曲霉群（Aspergillus flavus）。

综合2.2.3的形态学鉴定和海洋真菌MF-08的26S rDNA序列同源性比较结果可知，海洋真菌MF-08为黄曲霉群（Aspergillus flavus）。

2.3 壳聚糖酶部分酶学性质研究

2.3.1 壳聚糖酶反应的最适温度 在不同温度下测定海洋真菌MF-08产壳聚糖酶的活力，结果见图8。

温度是影响酶活性和稳定性的重要因素，该壳聚糖酶的最适反应温度和温度稳定性是判断其应用价值的重要考察指标。从图8可以看出，反应温度在40℃以下时，壳聚糖酶活力随着温度的升高而增加，40℃时酶活性最高，反应温度高于40℃后，酶活力随之降低。所以最适反应温度为40℃，与Katsuaki Hirano[8]研究结果相近。而王艳君[9]、阎贺静等[10]所研究菌株的壳聚糖酶的最适温度为55℃，袁建平等[11]所研究的为45℃。

图7 海洋真菌MF-08与相关菌株序列的26S rDNA基因序列的邻接法系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree showing the relationships of marine fungus MF-08 with the sequence of relating type genera constructed by the neighour-joining method and based on 26S rDNA gene sequences

图8 温度对壳聚糖酶活性的影响Fig.8 Effect of temperature on chitosanase activity

2.3.2 温度对壳聚糖稳定性的影响 壳聚糖酶在不同温度下保温10 min后，测得的剩余酶活见图9。

图9 温度对壳聚糖稳定性的影响Fig.9 Effect of temperature on the stability of chitosanase

如图9可知，在45℃以下，剩余酶活力可保持85%以上，当温度高于50℃时，酶活力急剧下降，55℃保温10 min后，剩余酶活力为50%，60℃以上保温10 min后，酶活力基本完全丧失。

该壳聚糖酶在30、40、50、60℃下放置不同时间后测得的剩余酶活力见图10。

图10 不同温度下壳聚糖酶在不同时间内的对热稳定性Fig.10 Effect of time on the stability of chitosanase under different temperature

从图10可知，40℃下随放置时间的延长，酶活力有一定的损失，60 min后剩余酶活力为70%，而30℃下放置的酶活力基本稳定。MF-08菌株的壳聚糖酶在较低温度条件下稳定性较高，具有一定的工业应用价值。

2.3.3 壳聚糖酶的最适反应pH pH会影响酶的构象，以及底物和酶分子活性部位有关基团的解离状态，影响酶的催化活性。因此酶的最适pH及其pH稳定性是酶应用价值的重要考察指标。由图11中可以看出，该壳聚糖酶的最适反应pH为5.2。与赵玉萍等[12]的研究结果基本相似。MF-08菌株所产壳聚糖酶具有较宽的pH范围，pH在4.4～5.8范围内相对酶活性仍能保持在0.8 U/mL以上。

图11 pH对壳聚糖酶活性的影响Fig.11 Effect of pH on chitosanase activity

2.3.4 pH对壳聚糖稳定性的影响 从图12可以看出，壳聚糖酶在pH4.0～6.0之间活力相对稳定，在此区间范围内，4℃下放置6 h后，壳聚糖酶的剩余酶活力仍能保持在原来的25%～30%。

2.3.5 金属离子对壳聚糖酶活性的影响 由图13可以看出，Mg2＋、Ca2＋、Zn2＋和Na＋对壳聚糖酶活力的影响都不是很明显。Cu2＋、Fe3＋和Hg2＋则会对壳聚糖酶活性具有很明显的抑制作用，尤其是Hg2＋。这和杨立红[13]和Anh Dzung Nguyen[14]的研究结果基本一致。原因在于壳聚糖与重金属离子的螯合作用，从而干扰壳聚糖酶对底物的降解，导致酶活性降低。

图12 pH对壳聚糖酶稳定性的影响Fig.12 Effect of pH on the stability of chitosanase

图13 属离子对壳聚糖酶活性的影响Fig.13 Effect of metal ions on chitosanase activity

3 结论

3.1 从实验室保存的20支产壳聚糖酶的菌种中分离纯化出一株产壳聚糖酶活力较高并能稳定遗传的海洋真菌MF-08作为出发菌株。

3.2 对菌株MF-08进行了形态学鉴定和26S rDNA序列比对分析，确定海洋真菌MF-08为黄曲霉群（Aspergillus flavus）。

3.3 海洋真菌MF-08部分酶学性质的研究表明：壳聚糖酶的最适作用温度和最适反应pH分别为40℃和pH5.2，酶活在pH4.0～6.0和小于40℃范围内相对稳定；Mg2＋、Ca2＋、Zn2＋和Na＋对壳聚糖酶活力的影响都不是很明显，Cu2＋、Fe3＋和Hg2＋则会对壳聚糖酶活性具有很明显的抑制作用，尤其是Hg2＋。

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Isolation，identification and enzyme characteristics of the chitosanase producing marine fungal MF-08

LI Jia-yin，WANG Hui-min，ZU Guo-ren*
（School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Isolated and purified a high enzyme activity strain from the chitosanase producing Marine fungi which preservation in laboratory，it was named MF-08.Based on the 26S rDNA sequence analysis and morphological properties，Marine fungi MF-08 was assessed to be Aspergillus flavus.The optimum temperature of chitosanase was 40℃，the optimum pH was 5.2，the chitosanase was stable below 40℃ and pH4.0～6.0，respectively.The enzyme activity was inhibited by Cu2+，Fe3+and Hg2+.

marine fungal；chitosanase；26S rDNA

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0193-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.032

2015－03－09

李佳茵（1990-），女，硕士研究生，研究方向：微生物生物活性物质，E-mail：m15140402799@163.com。

*通讯作者：祖国仁（1963-），男，教授，研究方向：微生物生物活性物质，E-mail：rgz321@163.com。