刘 英，曲 媛，崔秀明

（昆明理工大学生命科学与技术学院，中药质量与资源利用滇澳联合实验室，云南昆明650500）

分析检测

高效液相色谱法测定三七地上部分维生素含量

刘 英，曲 媛，崔秀明*

（昆明理工大学生命科学与技术学院，中药质量与资源利用滇澳联合实验室，云南昆明650500）

采用高效液相色谱法测定三七地上部分水溶性维生素以及脂溶性维生素的含量。三七茎叶中与三七花中各检测出5种维生素，但种类有所差异，两者所检测出维生素标准曲线的相关系数均达0.9990以上。三七茎叶与花中所检测水溶性维生素均以叶酸含量为最高，平均含量分别为0.1291%，0.1910%～0.3163%；两者均仅检测出一种脂溶性维生素VK1，平均含量分别为0.0033%，0.0009%～0.0012%。本研究的方法操作简便，结果准确，为三七地上部分新食品原料的开发研究提供科学依据。

高效液相色谱法，三七地上部分，水溶性维生素，脂溶性维生素，含量测定

三七地上部分为五加科人参属植物三七[Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]的干燥茎叶和花序，主产于我国云南和广西[1]。大量药理研究表明，三七地上部分中的有效成分具有抗炎、镇静、镇痛、抗抑郁、抗肿瘤、延缓衰老、提高免疫力、活血化瘀、抗高血压等作用[2-9]，在民间，三七茎叶、花均有作为茶叶、菜肴食用的历史，许多企业也以其为原料加工成各种食品、饮料以及保健食品[10]，但《中华人民共和国食品卫生法》的有关规定使三七地上部分的食用存在不合法的问题。有研究[11]表明，三七地上部分包含丰富的营养物质，包括一般营养元素粗蛋白、粗纤维、糖类以及矿质元素等，维生素（包括水溶性与脂溶性维生素）也是衡量营养价值的重要指标[12-14]。目前仅有少量报道[15]对三七地上部分的水溶性维生素进行了含量测定，但仅局限在VC含量的测定，测定指标单一。本研究采用高效液相色谱法对三七地上部分的10种水溶性与5种脂溶性维生素进行含量测定，同时为三七地上部分新食品原料的开发研究提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

对照品维生素C（编号：100425-201103，含量：100%）、维生素B1（编号：100390-200703，含量：99.9%）、维生素B3（编号：100434-201102，含量：99.9%）、维生素B6（编号：100116-200502，含量：98%）、烟酰胺（编号：100115-200703，含量：99.9%）、维生素B5（编号：100370-200301，含量：99.9%）、叶酸（编号：100074-201214，含量：89.7%）、生物素（编号：100291-201303，含量：99.6%）、维生素B12（编号：100248-201203，含量：90.2%）、维生素B2（编号：100369-201103，含量：99.1%）、维生素A（编号：100368-201301，含量≥95%）、维生素D2（编号：100155-201207，含量：99.9%）、维生素D3（编号：100061-201208，含量：99.8%）、维生素E（编号：100062-201110，含量：98%）、维生素K1（编号：100156-201205，含量：98%） 均购自国家标准物质网；超纯水 来自优普系列超纯水器；甲醇为色谱纯，其他所有试剂 均为国产分析纯；三七地上部分包括茎叶与花 2012年8～10月采集于云南省文山州与红河州各地。

LC-20AB高效液相色谱仪 日本岛津公司，包括在线脱气机DGU-20A3R（C）、二元泵LC-20AB、自动进样器SIL-20A、柱温箱CTO-20A、检测器SPD-20A；Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色谱柱 美国Thermo Scientific公司，250 mm×4.6 mm，5 μm；UPT-I-20T优普系列超纯水器 成都超纯科技有限公司；CP114电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司；TD25-WS台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

1.2.1.1 水溶性维生素色谱条件 色谱柱：Thermo Scientific Hypersil Gold（4.6 mm×250 mm）；流动相：0.05 mol/L KH2PO4溶液（pH=4.0）（A）-甲醇（B），进行梯度洗脱：0 min 5%B，5 min 5%B，15 min 10%B，35 min 40%B；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：210 nm，进样量为10 μL。

1.2.1.2 脂溶性维生素色谱条件 色谱柱：Thermo Scientific Hypersil Gold（4.6 mm×250 mm）；流动相：水（A）-乙腈（B），进行线性洗脱：0 min 90%B，30 min 90%B，40 min 100%B；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：275 nm。进样量为10 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备

1.2.2.1 水溶性维生素对照品溶液的制备 精密称取水溶性维生素VC、VB1、VB3、VB6、烟酰胺、VB5、叶酸、生物素、VB12、VB2对照品，加水配制成每毫升各含VC、VB1、VB3、VB6、烟酰胺、VB5、VB2为3.52、3.01、0.62、1.03、0.61、2.38、0.19 mg的混合溶液，加乙醇配制成每毫升各含叶酸、生物素、VB12为0.43、0.49、6.78 mg的混合溶液，浓度分别为20、10、10、10、10、10、0.5 mmol/L和1、2、5 mmol/L的对照品溶液。

1.2.2.2 脂溶性维生素对照品溶液的制备 精密称取脂溶性维生素A、D2、D3、K1对照品，加甲醇配制成每毫升各含维生素A、D2、D3为1.44、1.98、1.92 mg的混合溶液，加甲醇配制成每毫升含维生素K1为2.26 mg的混合溶液，浓度均为5 mmol/L的对照品溶液；精密吸取脂溶性维生素E对照品，加甲醇配制成每毫升含维生素E 2.16 mg的混合溶液，浓度均为5 mmol/L的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

1.2.3.1 水溶性维生素提取 称量0.50 g三七茎叶/花粉末，加入4 mL 0.1 mol/L HCl研磨，超声提取20 min，3500 r/min离心15 min，上清液定容至10 mL量瓶中，经0.45 μm滤膜过滤所得续滤液，作为供试品溶液[16]，进样量为20 μL。

1.2.3.2 脂溶性维生素提取 称量1.0 g三七花/茎叶粉末，20 mL无水乙醇，超声30 min，40℃摇床振荡50 min，3500 r/min离心15 min，收集上清液。残渣用10 mL无水乙醇洗3次，合并上清液。加入10 mL 10% NaCl，混匀，再加30 mL正己烷萃取，静置分层，收集上层（正己烷层），再加10 mL正己烷萃取，合并正己烷层，旋干，1 mL（氯仿∶甲醇=1∶4）溶出[17]，20 μL进高效液相。

1.2.4 标准曲线绘制

1.2.4.1 水溶性维生素 分别精密吸取水溶性维生素VB1、VB3、VB6、烟酰胺、VB5对照品溶液各0.1、0.5、1、10、25、50 μL，加水配制成浓度分别为0.002、0.01、0.02、0.2、0.5、1.0 mmol/L的对照品溶液；

精密吸取VB12对照品溶液0.5、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 μL，加水配制成浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mmol/L的对照品溶液；

精密吸取VC对照品溶液0.125、25、50、125、250、500 μL，加水配制成浓度为0.005、1.0、2.0、5.0、10、20 mmol/L的对照品溶液；

精密吸取生物素对照品溶液12.5、25、50、125、250、500 μL加乙醇配制成浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L的对照品溶液；

精密吸取叶酸对照品溶液1、2、5、10、100、250 μL，加乙醇配制成浓度为0.002、0.004、0.01、0.02、0.2、0.5 mmol/L的对照品溶液；

精密吸取VB2对照品溶液2、5、10、20、100、250 μL，加水配制成浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.1、0.25 mmol/L的对照品溶液。

1.2.4.2 脂溶性维生素 分别精密吸取脂溶性维生素A、D2、D3、K1对照品溶液各0.2、5、20、50、100、200 μL，加甲醇配制成浓度分别为0.002、0.05、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol/L的对照品溶液；精密吸取维生素E对照品溶液0.6、15、60、150、300、500 μL，加甲醇配制成浓度分别为0.006、0.15、0.6、1.5、3、5 mmol/L的对照品溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱结果

按照1.2.1.1色谱条件对三七地上部分水溶性维生素进行含量测定，对照品及三七地上部分样品的色谱图见图1，色谱图基线平稳，水溶性维生素VC、VB1、VB3、VB6、烟酰胺、VB5、叶酸、生物素、VB12、VB2分离程度较好；按照1.2.1.2色谱条件进行测定，对照品维生素A、D2、D3、E、K1及样品的色谱图见图2，色谱图基线平稳，但由于维生素D2、D3的性质相近，因此两者很难分开。

图1 水溶性混合对照品（A）、三七茎叶样品（B）和三七花样品（C）高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed water-soluble standard sample（A），the sample of stems and leaves of Panax notoginseng（B）and the sample of flowers of Panax notoginseng（C）

图2 脂溶性混合对照品（A）、三七茎叶样品（B）和三七花样品（C）高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed fat-soluble standard sample（D），the sample of stems and leaves of Panax notoginseng（E）and the sample of flowers of Panax notoginseng（F）

2.2 线性关系考察

取1.2.4.1与1.2.4.2中各系列对照品溶液测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，样品量为横坐标，作线性回归，得回归方程，结果见表1，10种水溶性维生素与5种脂溶性维生素的R2值均大于0.9990。

表1 标准曲线的回归方程Table 1 Regression equation of standard curve of vitamins

2.2.1 精密度、重复性、稳定性考察 取1.2.2.1中水溶性维生素对照品溶液各50 μL，混合，取1.2.2.2中脂溶性维生素对照品溶液各100 μL，混合，分别连续进样5次，测得水溶性维生素VC、VB1、VB3、VB6、烟酰胺、VB5、叶酸、生物素、VB12、VB2百分含量的RSD分别为0.31%、2.20%、0.05%、0.03%、2.55%、0.04%、2.73%、1.21%、0.03%、0.09%，脂溶性维生素A、D2、D3、E、K1百分含量的RSD分别为0.60%、0.14%、0.16%、0.69%、0.69%，表明仪器精密度良好；按平行制备三七茎叶/花供试品各6份测定含量，测得三七茎叶样品中维生素C、烟酰胺、叶酸、生物素、维生素K1百分含量的RSD分别为3.07%、3.69%、2.36%、1.37%、2.46%，三七花样品中维生素C、烟酰胺、维生素B5、维生素K1、叶酸百分含量的RSD分别为2.54%、1.27%、3.24%、2.79%、3.09%，均小于4%，表明该实验方法重复性良好；取1.2.3中三七茎叶/花的供试品溶液，分别在0、1、2、3、4、5 h进样，分别计算所测维生素的百分含量以及RSD值，结果得三七茎叶样品中维生素C、烟酰胺、叶酸、生物素、维生素K1百分含量的RSD分别为3.11%、3.23%、1.46%、1.97%、1.39%，三七花样品中维生素C、烟酰胺、维生素B5、叶酸、维生素VK1百分含量的RSD分别为2.26%、1.72%、2.34%、3.15%、2.42%，说明供试品溶液在5 h内稳定。

2.2.2 加样回收率实验 取已知水溶性/脂溶性维生素含量的三七茎叶/花样品各6份，在三七茎叶样品中分别精密加入适量的维生素C、烟酰胺、叶酸、生物素、维生素K1对照品，在三七花中加入适量的维生素C、烟酰胺、维生素B5、叶酸、维生素K1对照品，按照1.2.3.1/1.2.3.2制备供试品溶液，取按照各自的线性回归方程，测定含量，计算加样回收率，结果三七茎叶样品中水溶性维生素VC、烟酰胺、叶酸、生物素、脂溶性维生素VK1的平均回收率分别为107.91%（RSD=1.46%，n=3）、95.26%（RSD=2.11%，n=3）、97.71%（RSD=1.63%，n=3）、105.04%（RSD=2.33%，n=3）和98.91%（RSD=2.16%，n=3）；三七花样品中水溶性维生素VC、烟酰胺、维生素B5、叶酸、脂溶性维生素VK1的平均回收率分别为103.97%（RSD=1.73%，n=3）、93.02%（RSD=1.78%，n=3）、104.17%（RSD=2.45%，n=3）、91.79%（RSD=2.35%，n=3）和99.42%（RSD= 1.73%，n=3）。

2.3 样品测定结果

2.3.1 三七茎叶维生素含量测定 红河州与文山州各地三年生三七茎叶维生素含量结果见表2。由表2可得，在所检测的10种水溶性维生素以及5种脂溶性维生素中，三七茎叶中共检测出5种，即水溶性维生素C、烟酰胺、叶酸、生物素、脂溶性维生素K1，其他维生素均未检测出。

表2 不同产地三年生三七茎叶中维生素含量Table 2 Determination of vitamins from the triennial stems and leaves of Panax notoginseng in different areas

表3 不同产地不同生长年限三七花中维生素含量Table 3 Determination of vitamins from the flowers of Panax notoginseng in different areas and with different growth years

不同产地三年生茎叶中所检测出的水溶性维生素：VC含量范围为0.0046%～0.0119%，烟酰胺含量范围为0.0034%～0.0134%，叶酸含量范围为0.0510%～0.3788%，生物素含量范围为0.0218%～0.0809%，4种水溶性维生素的含量平均值从大到小依次为叶酸、生物素、维生素C、烟酰胺，数值分别为0.1291%、 0.0482%、0.0089%、0.0056%；脂溶性维生素K1含量范围为0.0009%～0.0140%，平均值为0.0033%。在不同产地的三七茎叶的比较中，以文山州文山县东山乡的5种维生素总和含量最高，为0.4357%，以红河州蒙自市的维生素总和最低，为0.0908%。

2.3.2 三七花维生素含量测定 不同产地不同生长年限的三七花维生素含量结果见表3。由表3可得，在所检测的10种水溶性维生素以及5种脂溶性维生素中，三七花中共检测出5种，即水溶性维生素VC、烟酰胺、维生素B5、叶酸、脂溶性维生素K1，其他维生素均未检出。

不同产地不同生长年限的三七花，水溶性维生素VC含量范围为0.0005%～0.0021%，烟酰胺含量范围为0.0021%～0.0185%，维生素B5含量范围为0.0220%～0.1130%，叶酸含量范围为0.0087%～0.3797%，4种水溶性维生素的含量平均值从大到小依次为叶酸、维生素B5、烟酰胺、维生素C；脂溶性维生素含量范围为0.0005%～0.0012%。

文山州不同生长年限三七花相比较，二年生与三年生三七花中5种维生素含量总和相比，二年生大于三年生三七花，分别为0.5003%（二年生）、0.3306%（二年生）、0.1351%（三年生）；三年生不同产地三七花相比较，文山州文山市1三七花中5种维生素含量总和最小，为0.1351%，红河州建水县三七花中5种维生素含量总和最大，为0.3507%。

3 结论

3.1 采用高效液相色谱法测定不同产地不同生长年限的三七地上部分的10种水溶性维生素以及5种脂溶性维生素的含量。结果发现在三七茎叶与花样品中所检测到的水溶性维生素种类不完全相同，三七茎叶样品中检测到的4种水溶性维生素包括维生素C、烟酰胺、叶酸、生物素，而三七花中检测到的4种水溶性维生素包括维生素C、烟酰胺、叶酸、维生素B5；在三七茎叶与花中均仅检测到脂溶性维生素K1。

3.2 有研究[15]发现三七茎叶中维生素VC含量与三七花的含量相差不大，但本研究测定的三七茎叶中维生素VC含量与三七花含量的平均值分别为0.0089%、0.0014%，三七茎叶明显高于三七花中VC的平均含量，可能是由于制备方法以及色谱峰分离条件的不同所致；三七茎叶中的烟酰胺含量（0.0056%）与三七花中的含量（0.0062%，0.0073%）相差不大，而叶酸平均含量则是三七花（0.3163%，0.1910%）高于三七茎叶（0.1291%）。脂溶性维生素VK1的平均含量则是三七茎叶（0.0033%）普遍高于三七花（0.0012%，0.0009%）。

3.3 三七地上部分所检测出的维生素种类包括水溶性维生素VC，烟酰胺，叶酸，生物素，维生素B5以及脂溶性维生素VK1，这几种维生素对人体均具有一定营养价值与功效[18-24]。三七茎叶与花中所检测水溶性维生素均以叶酸含量为最高，平均含量分别为0.1291%，0.1910%～0.3163%，高于以菠菜为首的一般蔬菜中叶酸的含量[25]；而在三七茎叶与花中检测出的唯一一种脂溶性维生素VK1，则高于以芹菜中VK1含量为首的47种蔬菜[26]。因此，三七地上部分可以作为日常补充维生素的良好来源。

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Determination of vitamins in aerial part of Panax notoginseng by high performance liquid chromatography

LIU Ying，QU Yuan，CUI Xiu-ming*
（Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Joint Laboratory of Quality and Utilization of TCM Resources in Dian and Macao，Kunming 650500，China）

The contents of water-soluble and fat-soluble vitamins in aerial part of Panax notoginseng were determined by high performance liquid chromatography.Five kinds of vitamins were respectively determined in the stems and leaves and in the flowers of Panax notoginseng，but there were some differences in the kinds of vitamins between the two parts.The correlation coefficients of vitamins were more than 0.9990.The content of Folic acid in the water-soluble vitamins which were determined was highest in the two parts，and the average content was 0.1291%in the stems and leaves and 0.1910%～0.3163%in the flowers.VK1was the only fatsoluble vitamin which was determined in the two parts，and the average content was 0.0033%in the stems and leaves and 0.0009%～0.0012%in the flowers.The method of this research was simple and accurate.The result could be used to lay the foundation for the research and development of the aerial part of Panax notoginseng as new resource food.

HPLC；aerial part of Panax notoginseng；water-soluble vitamins；fat-soluble vitamins；content determination

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.001

2015－03－01

刘英（1988-），女，在读硕士研究生，研究方向：天然产物研究，E-mail：308168275@qq.com。

*通讯作者：崔秀明（1963-），男，研究员，研究方向：生药学，E-mail：sanqi@vip.sina.cn。

中央本级重大增减支项目（2060302）；昆明理工大学分析测试基金（20140699）。