高风坤，陆 蕾，张文婧，程才红，侯文龙，杨越冬

(河北科技师范学院河北省天然产物活性成分与功能重点实验室，河北 秦皇岛，066004)

壳聚糖的分子量相对较大，小到数万大到数百万不等，独特的结构和较大的分子量使得其溶解性较差，在水中不溶解，可以溶解于弱酸，在很大程度上限制了它的应用[1,2]。

提高壳聚糖溶解性的方法之一是通过增加亲水性官能团来修饰分子结构。壳聚糖含有多个羟基(C-6上的伯羟基和C-3上的仲羟基)和高活性(C-2)氨基[3]，可通过不同的方法进行修饰。国内外研究者已对壳聚糖的氧化进行了大量的探究。Coseri等[4]研究表明，氮氧自由基2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)催化氧化还原体系可以氧化脂肪族和芳香族醇，是一种有效的催化体系。Bragd P等[5]使用TEMPO/NaClO/NaBr氧化体系将壳聚糖C-6位氧化，但由于卤化试剂(NaClO和NaBr)和有机溶剂的使用，会对环境造成一定的污染。使用TEMPO-漆酶来氧化壳聚糖是对TEMPO氧化体系的很好的补充[6]。TEMPO-漆酶可用于促进壳聚糖的区域选择性氧化，以生产具有新的生物活性的定制衍生物[7]。但是TEMPO只能溶于有机溶剂，对氧化的底物有一定要求，体系氧化度不高，氧化醇到羧酸比较困难，大多氧化为醛或者酮。Whistler等[8]使用N2O4作为氧化剂，将固体N2O4挥发成气体后隔湿氧化壳聚糖，测得氧化度不理想，且发生了主链降解及部分氧化脱氨。Horton等[9]采用CrO3作为氧化剂，先将醇羟基氧化成醛基，然后加水使醛基氧化为羧基，最后滴加NaOH溶液，使得C-6羧基形成钠盐形式，但其配位吸附的Cr3+很难除净。

本次研究拟使用NO2作为氧化剂来氧化不同分子量的壳聚糖，研究不同分子量对其被氧化程度的影响，通过对壳聚糖进行氧化来解决壳聚糖溶解性较差且难以应用的问题，并对氧化后得到的6-羧基壳聚糖在不同溶剂中的溶解性进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

50，200，1 000 ku分子量壳聚糖引自济南海得贝海洋生物工程有限公司；冰乙酸(优级纯)、无水乙醇(分析纯)、铜片(分析纯)、硝酸(分析纯)、甲醛(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、苯(分析纯)、吡啶(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、二甲基亚砜(分析纯)、NaOH(分析纯)均购自天津欧博凯化工有限公司。

1.2 制备方法

1.2.1NO2气体的制备通过铜片与浓硝酸反应来制备NO2，将制备的NO2气体用向上排空气法收集到广口瓶中，将尾气通入到NaOH溶液中。

1.2.2 6-羧基壳聚糖的制备将3种不同分子量的壳聚糖分别浸泡在冰乙酸中充分接触2 h，然后将制得的NO2气体通入到装有磁力搅拌的反应装置中。在10 h内匀速的通入16气瓶NO2气体，停止通气反应一夜，再通入16气瓶NO2气体，停止通气后继续反应一夜，整个反应过程中尽量隔绝水气。向装置中加入同体积的无水乙醇，充分搅拌，抽滤，再用无水乙醇洗涤3次。干燥得到3种不同分子量的6-羧基壳聚糖(图1)。

图1 NO2氧化壳聚糖原理

1.3 表征手段

利用傅立叶变换红外光谱仪(德国布鲁克公司生产，TENSOR 27)对样品分子结构和化学组成进行分析；使用差热热重同步分析仪(德国耐驰公司生产，STA 4094 PC)测定样品的热稳定性；使用场发射扫描电镜(日本日立公司生产，SU8010)对样品形貌进行观察；使用X射线衍射仪(日本理学公司生产，D/max-2500PC)对样品进行物相分析。

1.4 氧化度测定

根据公式(1)对6-羧基壳聚糖的氧化度(DO)进行测定[10,11]。

(1)

式中：c，v分别是NaOH标准溶液的浓度(mol/L)和体积(mL)。

m为样品中壳聚糖分子链上羟甲基(—CH2OH)被氧化成羧基(—COOH)的单元数(mol)。

(2)

式中：DO为氧化度，w为样品质量，X为原料壳聚糖脱乙酰度。

1.5 溶解性

将乙酸乙酯，乙醇，甲醇，二氯甲烷，苯，水，DMSO，DMF，0.3 mol/L NaOH溶液，0.2 mol/L稀乙酸溶液，吡啶各取3 mL分别倒进装有10 mg 6-羧基壳聚糖的玻璃小瓶中，溶解24 h，观察6-羧基壳聚糖在各个溶剂中的溶解性。

2 结果与分析

2.1 氧化度

测定结果表明，50 ku分子量6-羧基壳聚糖氧化度为33.18%；200 ku分子量6-羧基壳聚糖氧化度为39.94%；1 000 ku分子量6-羧基壳聚糖氧化度为54.54%。在相同的制备条件下，氧化度随着壳聚糖分子量的增大而升高，说明壳聚糖的分子量越高越容易被氧化。

2.2 红外光谱分析

2.2.1壳聚糖3种不同分子量的壳聚糖的红外光谱分析结果表明，壳聚糖的特征伸缩振动吸收峰位置都与文献[12]一致(图2)。在3 427.44 cm-1处的强而宽的峰为O—H和N—H的伸缩振动吸收峰；在2 872.26 cm-1和2 918.54 cm-1处的峰为—CH对称伸缩振动吸收峰和—CH2不对称伸缩振动吸收峰；在1 649.10 cm-1处为酰胺Ⅰ带吸收峰；在1 598.95 cm-1处为壳聚糖分子中—NH2的面内弯曲振动吸收峰；1 421.51 cm-1处吸收峰为—CH2弯曲和—CH3变形振动吸收峰；1 381.08 cm-1处为—CH弯曲振动和对称变形振动吸收峰；在1 155.33 cm-1处的吸收峰为吡喃环中不对称氧桥伸缩振动；在1 078.19 cm-1附近的二级羟基C—O伸缩、1 031.89 cm-1处的一级羟基的C—O伸缩和氨基的C—N伸缩振动吸收峰重叠，在1 000～1 100 cm-1范围内形成较强较宽的吸收峰；896.88 cm-1处的伸缩振动吸收峰为β-吡喃糖苷的特征吸收峰。在1 649.10 cm-1与1 598.95 cm-1处的吸收峰强弱可初步判断壳聚糖分子的脱乙酰度，后者峰强相比前者越大，表明壳聚糖分子脱乙酰度越高。

图2 壳聚糖的红外光谱a，50 ku分子量壳聚糖；b，200 ku分子量壳聚糖；c，1 000 ku分子量壳聚糖

2.2.2 6-羧基壳聚糖3种6-羧基壳聚糖的红外光谱结果表明，3种壳聚糖都成功被氧化(图3)。在1 031.89 cm-1处吸收峰强度明显减弱，说明C-6上的醇羟基被氧化；在1 726.25 cm-1处出现羧基的伸缩振动吸收峰，说明醇羟基被氧化为羧基。3种不同分子量的壳聚糖都成功被氧化为6-羧基壳聚糖，且随着壳聚糖分子量的增大，羧基的吸收峰也越来越强，说明6-羧基壳聚糖的氧化率随着分子量的增大而提升，此结论与氧化度测定结果吻合。

图3 6-羧基壳聚糖的红外光谱a，50 ku分子量6-羧基壳聚糖；b，200 ku分子量6-羧基壳聚糖；c，1 000 ku分子量6-羧基壳聚糖

2.3 热稳定性

2.3.1壳聚糖不同分子量壳聚糖在氮气气氛下，流量为30 mL/min，Al2O3坩埚，升温速率10 K/min，温度范围为20～800 ℃的热重分析 (TG)图谱表明，3种不同分子量壳聚糖的热分解为两个阶段(图4)，且分解温度基本相同。第一个分解阶段出现在80 ～110 ℃，主要是脱去部分水分，分子量大的壳聚糖失去质量较少；第二个分解阶段始于280 ℃左右，在500 ℃后，壳聚糖的质量趋于稳定。且分子量越大的壳聚糖分解的温度越高。50 ku分子量壳聚糖在284.2 ℃时开始分解，200 ku分子量壳聚糖在286.5 ℃时开始分解，1 000 ku分子量壳聚糖在287.0 ℃时开始分解。这一阶段为壳聚糖自身的热降解，包括壳聚糖的糖环的脱水，聚合物单元的解聚。

2.3.2 6-羧基壳聚糖比较3种不同分子量6-羧基壳聚糖的TG图谱和壳聚糖的TG图谱可以得出结论，壳聚糖比6-羧基壳聚糖热稳定性更好(图4，图5)。壳聚糖在结束热分解第一阶段的脱水后随着温度升高质量保持不变，说明分子内化学键更稳定；而6-羧基壳聚糖在失水后聚合物单元也开始断裂，糖环脱水，这是由于将壳聚糖C-6位醇羟基氧化为羧基破坏了壳聚糖原有的分子间的氢键。3种不同分子量的6-羧基壳聚糖的热稳定性相差不大，随着分子量增大，氧化度的提升对6-羧基壳聚糖的热稳定性也有影响(图5)。在热分解第二阶段，氧化度越高失去质量越迅速。由于氧化度升高导致氧含量升高，最终煅烧后剩余的残余质量随着氧化度的升高而减小。

图4 壳聚糖的TG图谱a，50 ku分子量壳聚糖；b，200 ku分子量壳聚糖；c，1 000 ku分子量壳聚糖图5 6-羧基壳聚糖的TG图谱a，50 ku分子量6-羧基壳聚糖；b，200 ku分子量 6-羧基壳聚糖；c，1 000 ku分子量6-羧基壳聚糖

2.4 物相分析

X射线衍射结果表明，3种壳聚糖的衍射峰位置重合(图5中的a，c，e曲线)。由于壳聚糖为低结晶性高分子，在2θ为20.38°处观察到的衍射峰为壳聚糖的非晶态聚合峰，与文献[12]中壳聚糖的特征衍射峰位置吻合。而3种6-羧基壳聚糖的衍射峰位置与壳聚糖基本一致(图5中的b，d，f曲线)，说明对壳聚糖C-6位进行羧基化并不会改变壳聚糖的晶型，分子链的规整性还保持完好，没有受到破坏。

2.5 形貌分析

在同一尺寸下观察3种不同分子量壳聚糖及其氧化物6-羧基壳聚糖的形貌，SEM形貌分析表明，壳聚糖形貌为多层纸片型结构重叠在一起的片层状结构，且表面粗糙，凹凸不平(图7)。壳聚糖的宽度在几十微米到100多微米，厚度为几微米；由于本反应属于非均相反应，反应前后对壳聚糖形貌未发生较大变化，6-羧基壳聚糖的形貌与壳聚糖基本相似，表面较壳聚糖更为粗糙。

图6 壳聚糖和6-羧基壳聚糖的XRD图谱50 ku分子量:a 壳聚糖，b 6-羧基壳聚糖；200 ku分子量：c 壳聚糖，d 6-羧基壳聚糖；1 000 ku分子量：e 壳聚糖，f 6-羧基壳聚糖

图7 壳聚糖及其衍生物的FESEM结果50 ku分子量：(a)壳聚糖，(d)6-羧基壳聚糖；200 ku分子量：(b)壳聚糖，(e)6-羧基壳聚糖；1 000 ku分子量：(c)壳聚糖，(f)6-羧基壳聚糖

2.6 溶解性

溶解性测试结果表明，分子量越大，6-羧基壳聚糖的溶解性越好。图8中的A，B，C分别为50，200，1 000 ku分子量6-羧基壳聚糖在不同溶剂中的溶解情况。可以看出，小分子量壳聚糖溶液的颜色淡黄；而大分子量壳聚糖溶液的颜色呈白色，氧化反应未改变产物颜色。6-羧基壳聚糖在水和稀乙酸溶液中溶解性最强，6-羧基壳聚糖完全溶解，在DMSO中大部分溶解，其次在苯、吡啶和氢氧化钠溶液中部分溶解，在其他溶剂中未溶解。对比不同分子量6-羧基壳聚糖在同一溶剂中的溶解情况，可以看到分子量越高在溶剂中的溶解性越好，这一结果正好和测得的6-羧基壳聚糖的氧化度结果相对应，6-羧基壳聚糖的氧化度越高，其在溶剂中溶解的越多，溶解性越好。

图8 3种6-羧基壳聚糖在不同溶剂中的溶解性A行，50 ku分子量6-羧基壳聚糖；B行，200 ku分子量6-羧基壳聚糖；C行，1 000 ku分子量6-羧基壳聚糖

3 结 论

本次试验使用NO2作为氧化剂来氧化3种不同分子量的壳聚糖制备6-羧基壳聚糖。通过XRD，SEM，FTIR，热重分析对壳聚糖和6-羧基壳聚糖进行了表征，测试其氧化度以及对其在不同溶剂中的溶解情况进行初步试验。试验结果表明：(1)使用NO2氧化法成功将壳聚糖的C-6位的醇羟基氧化为羧基，并制备出3种不同分子量6-羧基壳聚糖。(2)引入羧基使得6-羧基壳聚糖热稳定性变差但并未改变壳聚糖晶体晶型。(3)壳聚糖分子量越大氧化效果越好，1 000 ku分子量6-羧基壳聚糖的氧化度为54.54%，(4)3种不同分子量6-羧基壳聚糖在水和稀乙酸溶液中完全溶解，在DMSO中大部分溶解，其次在苯、吡啶和氢氧化钠溶液中部分溶解，在其他溶剂中未溶解。