闫泽晨，代醒，杨锦建，张俊杰，郭飞，余捷凯，郑树，王家祥(郑州大学第一附属医院，河南省泌尿外科研究所，郑州45005； 郑州大学第五附属医院；浙江大学第二医院肿瘤研究所)

儿童双侧肾母细胞瘤差异性表达蛋白的筛选

闫泽晨1，代醒2，杨锦建1，张俊杰1，郭飞1，余捷凯3，郑树3，王家祥1(1郑州大学第一附属医院，河南省泌尿外科研究所，郑州450052；2 郑州大学第五附属医院；3浙江大学第二医院肿瘤研究所)

摘要：目的采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术筛选双侧肾母细胞瘤(BWT)的差异性表达蛋白。方法选取BWT患儿血清标本10例(BWT组)，另选单侧肾母细胞瘤(UWT)患儿血清标本(UWT组)及健康儿童血清标本(对照组)各20例，采用SELDI-TOF-MS技术检测并收集相关数据。结果 应用生物信息学方法对所得数据进行分析，得到差异性峰10个(P<0.01)。对比各组差异性表达蛋白峰值数据，筛选出质子数/电荷数(m/z)为5 648 Da的差异性表达蛋白1个，其在BWT组、UWT组及对照组中表达强度分别为3 889.36±1 796.83、2 886.81±1 404.65、432.21±730.42，三组相比，P均<0.01。 结论 采用SELDI-TOF-MS技术成功筛选出一种BWT差异性表达蛋白，其有望成为BWT早期诊断及预后判断的新的标志物。

关键词：生物学标记；肾母细胞瘤；蛋白质组

肾母细胞瘤(WT)是儿童最为常见的一种原发性腹部实体器官恶性肿瘤，在中国发病率为2.5/100万。该病早期症状多无特异性，往往表现为可触及的无症状腹部肿块。其中，双侧肾母细胞瘤(BWT)发病率占所有WT的5%～7%，且5年生存率远低于单侧肾母细胞瘤(UWT)患者。但目前尚无用于BWT诊断的肿瘤标志物。蛋白质指纹技术又称表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术，能对不同组别生物样本的相关性蛋白质标志物表达情况进行筛选，为寻找与BWT相关的肿瘤标志物提供了可能[1,2]。2009年1月～2013年12月，我们分别采集了BWT患儿、UWT患儿及健康儿童的血清样本，并采用SELDI-TOF-MS技术对BWT差异性表达蛋白进行筛选[3]，现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1血清样本收集与处理于清晨空腹状态下分别采集10例BWT患儿(BWT组)、20例UWT患儿(UWT组)和20例健康儿童(对照组)的血清样本。BWT组男3例，女2例，年龄7～48个月，平均(34.20±12.41)个月，均经病理证实为BWT。UWT组男6例，女4例，年龄4～56个月，平均(41.20±10.12)个月，均经病理证实为UWT。对照组男5例，女5例，年龄4～74个月，平均(34.53±15.52)月。三组性别、年龄具有可比性。同时，根据WT的分期标准，所选取的BWT均为Ⅴ期，UWT为Ⅰ～Ⅳ期。所采集的血清样本于室温静置1～2 h后，3 000 r/min离心20 min，取上清液，分装于EP管中，于-80 ℃冰箱保存。

1.2试剂与仪器尿素(Urea)，醋酸钠(NaNC)，1,4-二硫苏糖醇(DTT)，甲基氰(ACN)，3-环已胺-1-丙磺酸(CHAPS)，三氟乙酸(TFA )及芥子酸(SPA)等购于Sigma公司。精密电子天平(AT261)购于Mettler公司。去离子纯水机(Milli-Q Plus)购于Millipore公司。雪花制冰机(YB-ZBJ-X40)购于Ross Temp公司。冷冻高速离心机(Sorvall Stratos)、-80 ℃超低温冰箱及微量移液器等购自Thermo公司。PBSⅡ+型SELDI-TOF-MS分析仪及弱阳离子交换芯片(WCX2)等购自Ciphergen Biosystem公司。

1.3差异性表达蛋白的筛选三组血清在冰浴上缓慢融解(30～60 min)，10 000 r/min、4 ℃离心5 min，取5 μL血清，加入10 μL U9血清处理液中，4 ℃条件下摇床上振荡使其充分混合(600次/min，共振荡30 min)；用Binding Buffer将U9处理后的血清稀释至200 μL，4 ℃摇床上振荡(600次/min，振荡2 min)后于WCX2蛋白芯片上样。先用已知分子量的标准蛋白芯片All-in-One将SELDI质谱系统的分子量误差校正至<0.1%，再将待测芯片放入质谱仪中检测[4,5]。

1.4数据分析应用Ciphergen Biosystems 3.1对所采集数据进行校正，使总离子强度与分子量均一化。用非抽样离散小波转换法对原始数据进行整理并作信号降噪处理。根据标记好的出现在所有选定光谱中的3个峰值，调整信号强度标记。采用对齐单调的最小曲线和质量校正的方法对光谱进行基线校正。过滤信噪比(S/N)>2的峰值。聚类分析的最小阈值设定为10%，并将各个样本中质子数/电荷数(m/z)差异<0.3%的峰值聚为同一类[6]。对找出的峰值在各个样本中的强度作均一化处理。将集内最大高度作为降值，代表蛋白表达强度。

1.5统计学方法将数据进行过滤噪音及聚类分析处理后，对筛选出的m/z峰值进行Wilcoxon秩和检验，各组数据两两比较采用进行t检验。检验标准α=0．01。

2结果

经SELDI-TOF-MS技术对各组血清样本进行筛选，得到一系列蛋白质表达强度数据。再将BWT组、UWT组及对照组的数据进行Wilcoxon秩和检验，筛选出差异性表达蛋白m/z的峰值。其中，BWT组与对照组中筛选出差异性蛋白峰值14个，其中8个在BWT组中高表达，4个在对照组中高表达；BWT组与UWT组筛选出差异性蛋白峰值10个，其中8个在BWT组中高表达，2个在UWT组中高表达；UWT组与对照组中筛选出差异性蛋白峰值13个，其中11个在BWT组中高表达，2个在对照组中高表达。对比各组差异性表达蛋白峰值数据，筛选出一种m/z 为5 648 Da的蛋白，其在BWT组、UWT组及对照组中的表达强度分别为3 889.36±1 796.83、2 886.81±1 404.65、432.21±730.42，三组相比，P均<0.01。

3讨论

WT又称为肾胚胎瘤，多发于儿童，50%的患儿于5岁前发病。该病早期无明显症状，多为父母为患儿洗澡或穿衣时被发现。BWT极为少见，其诊断与治疗均较UWT复杂。根据儿童肿瘤组织基于外科和组织病理学制定的WT分期标准，BWT属于Ⅴ期，其预后相对较差。虽然近年来超声、CT及MRI等影像学检查技术不断发展成熟，BWT的检出率也越来越高，然而对于一侧肿瘤直径<1.0 cm的BWT仍有一定的漏诊率[7]。BWT患儿早期确诊后行术前化疗有利于肿瘤切除，并可减少术中肿瘤破溃率及术后并发症。但目前针对BWT尚无一种高特异性的肿瘤标志物。因此，筛查BWT差异性表达蛋白对于提高BWT早期确诊率、减少漏诊及预后判断非常重要[8]。

蛋白质组学的概念由澳大利亚学者Marc Wilkins于1994年率先提出，指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。蛋白质组学方法旨在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的终产物进行定性及定量研究，从而揭示生命活动规律及基因表达调控机制[9]。SELDI-TOF-MS技术结合了芯片微阵列与质谱技术两者的优点，其将传统基质改为以色谱原理设计的蛋白质芯片，增强了其分离能力；芯片表面利用亲和力来捕获蛋白质的分子量、等电点、磷酸化位点及糖基化位点等信息[2]；利用激光脉冲辐射解吸芯片中的待测样本，形成荷电离子，后根据不同的质荷比及离子在仪器场中飞行时间不同来绘制质谱图，能检测出样品中各种蛋白质的分子量及表达水平。近年来，SELDI-TOF-MS技术已广泛应用于肿瘤、心脑血管疾病及免疫系统疾病等多种疾病的研究，同时也被认为是肿瘤早期标志物检测方面最有发展前景的一项技术[10]。该技术的出现及发展为我们寻找WT，尤其是BWT的差异性表达蛋白提供了新的思路与方法。

我们采用SELDI-TOF-MS技术对BWT组、UWT组及对照组血清蛋白进行筛选，得到m/z 为5 648 Da的差异性表达蛋白在BWT组、UWT组及对照组中的蛋白表达强度分别为3 889.36±1 796.83、2 886.81±1 404.65及432.21±730.42，三组两两比较，差异均有统计学意义。目前认为，组织病理学特征与分期是影响WT患儿预后的最主要因素。本研究中BWT患儿均属于Ⅴ期，而UWT患儿为Ⅰ～Ⅳ期。BWT组m/z 为5 648 Da的蛋白表达强度明显高于UWT组，与肿瘤分期有一定联系。且UWT组、BWT组m/z 为5 648 Da的蛋白表达强度均高于对照组，这说明该差异性表达蛋白在WT，尤其是BWT的生长与分化中可能起到一定的作用，有助于BWT的诊断及预后评估。

总之，本研究成功筛选出了一种在BWT与UWT、健康儿童之间差异性表达的蛋白，为后续差异性表达蛋白的鉴定及BWT的靶向治疗等相关研究提供了基础，同时其有望成为早期诊断BWT及判断预后的新的标志物[11,12]。然而由于BWT发病率低，本研究纳入样本量相对较少，故该差异性表达蛋白的可靠性有待于进一步验证。

参考文献：

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Screening of proteins associated with pediatric bilateral wilms tumor

YANZe-chen1, DAI Xing, YANG Jin-jian, ZHANG Jun-jie, GUO Fei, YU Jie-kai,

ZHENGShu,WANGJia-xiang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Abstract:ObjectiveTo select the differentially expressed proteins of bilateral wilms tumor (BWT) by using SELDI-TOF-MS technology. MethodsA total of 10 serum samples of children with BWT(BWT group), 20 serum samples of children with Unilateral Wilms Tumor (UWT group) and 20 serum samples of healthy children(control group) were selected. SELDI-TOF-MS technology was used to detect the differentially expressed BWT proteins. ResultsTen difference BWT proteins peaks were found(P<0.01). The highest Youden′s index was obtained to select one differentially expressed protein with m/z of 5 648 Da. The selected expression BWT protein in BWT group, UWT group and control group was 3 889.36±1 796.83, 2 886.81±1 404.65 and 432.21±730.42, respectively(all P<0.01). ConclusionA differentially expressed protein of BWT group was successfully obtained by using SELDI-TOF-MS technology, which is expected to be a new marker for the early diagnosis and prognosis of BWT.

Key words:bological markers; nephroblastoma; proteomics

(收稿日期：2014-11-28)

通信作者简介：王家祥(1958-)，男，博士，教授，主任医师，研究方向为腹部实体肿瘤的蛋白组学研究及小儿外科疾病的基础与临床。E-mail:wjxzzu@126.com

作者简介：第一闫泽晨(1988-)，男，博士，研究方向为腹部实体肿瘤的蛋白组学研究及泌尿外科疾病的基础与临床。E-mail：yanzechen@qq.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81172085/H1608)。

中图分类号：TQ937；R737.11

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)02-0008-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.003