孙雪 李明会 张庆 粟杨静

(西南林业大学，昆明，650224) (云南省森林灾害预警与控制重点实验室(西南林业大学))

泽漆(Euphorbia helioscopia)又名五朵云、五灯草、五风草等，属大戟科，全国分布广泛［1］，性微寒，味苦，有毒［2］，在民间多为全草入药，有利尿消肿、化痰、散结、杀虫止痒之功效［3］。因泽漆具有毒性，其良好的杀鼠活性为植物源灭鼠药增添了潜力和开发价值，但目前未见关于泽漆中毒后，中毒对象的主要生理指标变化与脏器损伤情况的文献报道。本研究对泽漆乙酸乙酯萃取物的GHS 毒性进行了别类划分，并对其LD50范围进行初步评估，以点斜法测定其LD50的具体数值，判断其灭鼠活性大小。试验过程中，观察、记录泽漆乙酸乙酯萃取物对小鼠的毒副作用。

1 材料与方法

1．1 试验材料

泽漆全草采于昆明市，粉碎，备用。试验用鼠为昆明小鼠远交系(KM 小鼠封闭群)，购自昆明医学院实验动物中心，体质量18～22 g。经过7 d 开放实验室的适应性饲养，喂食从昆明医学院实验动物中心购买的标准饲料与自来水。选择体质量不超过全部小鼠的平均体质量20%的小鼠进行试验。试验小鼠以3%～5%苦味酸标记。

1．2 试验方法

泽漆萃取物制备:泽漆全草经45 ℃烘干、粉碎、过40 目筛后以70%乙醇45 ℃恒温水浴提取。提取液以50 ℃恒温减压浓缩，回收溶剂至稠膏状。浓缩的提取物用2 倍体积的乙酸乙酯萃取4 次，萃取液再以50 ℃恒温减压浓缩，回收溶剂至稠膏状，即得到泽漆的乙酸乙酯萃取物。

泽漆乙酸乙酯萃取物毒性GHS 类别划分:根据《化学品急性经口毒性固定剂量试验方法》对泽漆乙酸乙酯萃取物的LD50范围进行评估。

预试验:在GHS 毒性类别的判断试验中，得出LD50的预计取值范围是170 ～450 mg·kg-1，属于危险级别的有毒物。

正式试验:根据预试验结果，总选取60 只KM小鼠，其中雌、雄小鼠各30 只［4］。用点斜法测定LD50，以0．8 的等比级数设置5 个灌胃剂量组，分别是179．20、224．00、280．00、350．00、437．50 mg·kg-1，每个剂量组灌胃10 只小鼠，雌、雄鼠各5 只，每5 只中选取中毒表现中等的小鼠作为解剖用，每只小鼠一次性灌胃试液体积0．2 mL。同时，另选雌、雄小鼠各5 只组成1 个空白组，一次性灌胃0．2 mL 蒸馏水。各组的雌、雄小鼠均分笼饲养。

1．3 数据处理

泽漆乙酸乙酯萃取物LD50的计算采用点斜法［5］200-210。

回归系数b=(¯yn-¯ye)/(iR)。

截距a=5-blogLD50。

回归方程y=a+bx。

死亡率为r 的致死剂量］。

logLDr的标准误。

logLDr的平均置信区间

式中:p 是死亡率;y 是死亡率对应的概率单位;¯yn是高半组y 值均数;¯ye是低半组y 值均数;R 是n 与e间相差的组数距;k 为分组组数;i 是相邻两组剂量对数值差;n 是每组动物数。

灌胃给药后对小鼠进行连续14 d 的观察，其中，每隔12 h 观察记录一次小鼠的行为与死亡数。小鼠校正死亡率=((试验组死亡率-对照组死亡率)/(1-空白组小鼠死亡率))。

2 结果与分析

2．1 乙酸乙酯萃取物灌胃LD50

根据GHS 类别评价结果，泽漆乙酸乙酯萃取物的GHS 毒性类别为3 类，对其进行小鼠灌胃LD50测定。同时，根据点斜法相关公式，可以计算任意死亡率(r)下乙酸乙酯萃取物的灌胃剂量。以10 只小鼠为一组的试验出现死亡个体的最低死亡率是10%。因此，将10%死亡率时乙酸乙酯萃取物的剂量(LD10)作为最低致死剂量的估计值。试验中，高半组y 值均值¯yn=5．77，低半组y 值均值¯ye=4．16，高、低半组相差的组数距R=2，分组组数k=5，相邻两组剂量对数值差i=0．097，每组动物数n=10。其它相关数据见表1。测定结果表明，LD50的致死剂量为314．80 mg·kg-1，标准误为0．027 0，95%置信区间为(314．80±38．29)mg·kg-1，99%置信区间为(314．80±50．20)mg·kg-1;LD10的致死剂量为220．53 mg·kg-1，标准误为0．035 9，95%置信区间为(220．53±35．61)mg·kg-1，99%置信区间为(220．53±46．69)mg·kg-1。

表1 泽漆乙酸乙酯萃取物对小鼠灌胃LD50测定的数据

2．2 KM 小鼠日食量与体质量

采用小鼠个体的平均日食量、试验期间的平均体质量作为基础数据，对灌胃组和空白组小鼠间食量与体质量进行差异性分析。LD50测定试验中，灌胃280．00 mg·kg-1以上剂量的试验组中，雌、雄小鼠的平均日食量与空白组的差异显著。224 mg·kg-1试验组中雌鼠的平均日食量与空白组差异显著。灌胃280 mg·kg-1以上剂量的试验组中，雌、雄小鼠的平均体质量与空白组差异显著或极显著(表2)。

表2 KM 小鼠LD50测定试验组与空白组平均日食量、平均体质量的差异性

2．3 KM 小鼠脏器质量

根据LD50可以看出，350．00 mg·kg-1剂量及以上的试验组雌、雄小鼠的全部脏器系数均与空白组差异显著。同时，肝脏、脾脏和肺脏的脏器系数在低于350．00 mg·kg-1的剂量组中也有表现显著差异(表3)。

2．4 KM 小鼠中毒表现

GHS 试验中小鼠灌胃50 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物没有明显的毒性反应，灌胃乙酸乙酯萃取物300 mg·kg-1时，表现出明显的偏瘫、体质量和食量下降、伏地不动、行走摇摆、四肢抽搐、经常“嗤嗤”的打嗝(或咳嗽)等，并出现死亡。

对GHS 正式试验的全部小鼠进行解剖观察时发现:灌胃50 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物的小鼠脾脏体积偏大，肝脏颜色较暗。但是，对预试验中灌胃300 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物的小鼠解剖发现，其胃部胀大且胃壁布满血丝，胃肠内容物为暗红色黏稠液体，有明显的腐臭味。肝脏有明显的黑斑，肺脏多处出现暗红色斑点，肾脏表皮容易被剥落，其余没有肉眼可视病变。

表3 KM 小鼠LD50测定试验组与空白组脏器质量系数的差异性

LD50测定试验的小鼠除了表现出与GHS 类别评价试验中灌胃300 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物的小鼠相同的症状外，在350．00 mg·kg-1与437．50 mg·kg-1剂量组中还发现小鼠排泄物的酸臭味比低剂量组及空白组明显，且小鼠在死亡前出现明显的食量、体质量与体温下降。同时，在最高剂量组中小鼠的肺脏和肝脏病变更明显，胃肠道变成暗红色，心脏局部变黑或出现血管突出明显。

3 结论与讨论

在乙酸乙酯萃取物LD50的测定试验中，共死亡了26 只小鼠且并没有发现雌鼠比雄鼠表现出更明显的中毒症状，或是有更高的死亡率、更快的死亡速度。泽漆乙酸乙酯萃取物的LD50为314．80 mg·kg-1，95%置信区间为(314．80±38．29)mg·kg-1。

试验小鼠的中毒症状与解剖结果与生物碱、黄酮类物质中毒症状有较大的相似性。乌头类生物碱可以导致呼吸困难，甚至衰竭，可使运动神经先兴奋后麻痹，然后丧失知觉，常表现运动障碍;山黧豆(Lathyrus sativus)生物碱可使中毒动物表现运动能力衰弱，身躯麻痹，呼吸困难等，同时引起肝、脾、肾肿大，心室充满暗红色血液，外观变暗等病变［5］200-210。结合泽漆成分大类定性结果，初步估计泽漆的主要有毒成分可能与生物碱或黄酮类物质有关。

试验结果把泽漆乙酸乙酯萃取物GHS 类别划定为3 类，同时LD50的计算结果也都显示泽漆乙酸乙酯萃取物有较好的杀鼠活性。

试验动物的各项生理生化指标，例如:体质量、脏器质量系数、血常规等，通常被用于试验动物标准化饲养、药品动物试验、疾病动物模型研究的主要参考指标［6］，饲料配方的变化、取食方式、试验环境不同等原因都有可能影响不同批次的KM 小鼠的生物学指标［7-9］，因此，KM 小鼠的相关试验更多采用在同等条件下，以同批次试验动物设置空白对照组，通过对比试验组与空白组的差异，说明试验组动物的变化。本次试验采用动物生理指标中的食量、体质量、脏器质量系数对小鼠灌胃泽漆乙酸乙酯萃取物后的生理变化进行了探索。试验结果表明，乙酸乙酯萃取物不仅能够造成小鼠多器官肉眼可视病变，还能引起食量、体质量、脏器质量系数的明显变化。但是，在试验当中出现了小鼠体质量的明显下降，因此，脏器质量系数的显著变化有可能是萃取物毒性引起的，也有可能是体质量显著下降引起的假阳性结果。其中的变化机制与实质影响还需要进一步开展生化指标检验、组织检验等研究加以解释。同时，泽漆乙酸乙酯萃取物对小鼠其他生理生化方面的具体影响也还有待更广泛深入的研究。

综上所述，泽漆乙酸乙酯萃取物具有良好的杀鼠活性并具有较好地开发为植物源灭鼠药的潜力，有进一步研究与开发价值。

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［6］ 苗明三．实验动物与动物实验技术［M］．北京:中国中医药出版社，2003:2-7，90-97，118-170，330-340．

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［8］ 朱冬琴，谢恩，顾建忠，等．不同日龄昆明小鼠外部形态数量性状与肥满度的关系［J］．上海交通大学学报:农业科学版，2003，21(1):43-45，50．

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