纪懿芳,胡文忠,姜爱丽,冯 可,董 妍

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)



海产品中副溶血弧菌检测方法研究进展

纪懿芳1,胡文忠2,*,姜爱丽2,冯 可3,董 妍1

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)

副溶血弧菌是主要的食源性致病菌之一,主要存在于鱼虾贝等海产品中。人们在食用被副溶血弧菌感染的海产品时,容易出现腹泻、呕吐、腹痛等急性肠胃炎症状。本文主要介绍了副溶血弧菌的分子生物学、免疫学等几种快速检测方法,并对未来的发展前景做了展望。

副溶血弧菌,检测方法

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,简称VP),是一种主要的食源性致病菌,嗜盐的革兰氏阴性细菌,属弧菌科弧菌属,广泛分布于沿海、河口环境和鱼、虾、贝等海产品中。近年来,全球所有已被确诊的腹泻性肠胃炎病例中,有50%～70%的感染者是由于食用未煮熟的海产品而导致的[1]。在我国,副溶血弧菌引起的食物中毒在所有的细菌性肠胃炎中占有较高的比重,危害较大。在中国报道的食物中毒病例中,由副溶血弧菌引起的病例占了31.1%。传统的副溶血弧菌的检测方法耗时长,操作繁琐,灵敏度低。因此,开发采用精确先进的生物化学方法,快速的检测副溶血性弧菌,提高食品的安全性,确保人民生命安全,减少财产损失显得尤为重要。

1 细菌培养法

近几年在原有标准方法的基础上形成了许多的新技术,以提高检测效率特别是缩短检测时间,包括国标分离培养结合API方法鉴定、选择性培养基等。沈玄艺[2]等人按国标方法从食品中分离2株弧菌,用Vitek-32型细菌鉴定仪和API-20E生化试剂鉴定分析,结果符合副溶血弧菌特征,生化结果与参考标准株ATCC18072和病人分离株的副溶血弧菌一致,可定为产色素的副溶血弧菌。实验操作简便用时短,API实验仅用18～24h即可完成生化鉴定。卢勉飞[3]等人开发出一种副溶血性弧菌显色培养基(HKMVPM),显色培养基上副溶血性弧菌菌落均呈现特异性的品红色,而非副溶血弧菌则表现为蓝绿色、无色等现象。与国外同类产品相比,分离率高低顺序为 HKMVPM>KHVPM>TCBS。显色培养基具有操作简单、高检出率及高特异性的特点,可进一步优化配方来增加颜色变化的敏感性和特异性使其拥有更良好的应用前景。

2 分子生物学方法

2.1 普通PCR

PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),是Mulis[4]在1985年发明的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术,具有特异性强、灵敏度高等特点。李青[5]等人对副溶血弧菌的不耐热溶血毒素tlh基因设计特异性引物,纯培养物检测灵敏度为1.0cfu/mL,人工污染样品检出率为100%。黄晨阳[6]等人根据副溶血弧菌的toxR基因设计特异性引物,建立优化PCR反应体系,提高灵敏度,检出限达到4×103cfu/mL。PCR操作简单,耗时短,但是容易被其他杂质和DNA污染而出现假阴性或者假阳性的结果,在进行PCR检测时,可以通过添加扩增内标、降低退火温度、对引物进行特异性实验等方法来排除假阴性。此外,PCR操作不可以区分活/死菌和没有毒力的致病菌而产生假阳性的结果,可以添加叠氮溴化丙锭等DNA染料降低假阳性率。传统PCR技术在灵敏度、特异性、仪器自动化程度和实验成本都有一定的局限性,所以在传统PCR基础上发展起来了许多PCR改进技术,如多重PCR、荧光定量PCR、巢式PCR等,从不同方面弥补传统PCR的不足。

2.2 多重PCR

2.3 实时荧光定量PCR法(RT-PCR)

实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence qualitative PCR),在基础的PCR反应体系中加入荧光基团,通过检测荧光量来测定样本的核酸量。荧光PCR具有高灵敏性和特异性,实验在封闭体系中完成,减少了污染的可能性,并可做到定性和定量分析等特点[10-11]。Garrido[12]等人分别从海水和海产品中分离得到副溶血弧菌进行实验,用多重荧光定量PCR同时检测副溶血弧菌的tdh和trh基因,tdh、trh1和trh2的检出限分别为26、11和8cfu/25g,此方法与国际标准方法相比时间可以缩短1/3。Blackstone[13]针对副溶血弧菌的tdh基因进行了实时荧光定量PCR,同时检测13株非副溶血弧菌细菌,只有副溶血弧菌的tdh基因显荧光。同时用AWM碱性蛋白胨水富集牡蛎中的副溶血弧菌结合实时PCR,24h内可以检测61份样品,比普通的平板划线富集法检测多4倍。林强[14]等人以副溶血弧菌的毒素调控基因toxR,设计特异性引物及TaqMan探针。用荧光定量PCR方法对含toxR基因质粒、纯培养物和人工污染的牡蛎样品进行灵敏度实验,灵敏度分别为15拷贝、18cfu/mL和180cfu/mL,多次重复变异系数在1%左右。荧光定量PCR探针成本高、设计难,在实验中我们要确保引物的特异性和条件的最优化。TaqMan和分子信标荧光探针是荧光定量PCR的检测主流,随着探针技术的发展,出现更稳定更特异的探针,如可以快速产生信号的Scorpion探针和设计简单、成本低、特异性可灵活改变的双链探针,此外还有cycling探针、Simple探针和神标荧光探针。同时,数据软件的更新改进,与其它技术连用和更灵敏的荧光标记材料的不断出,将是此技术未来发展的主流趋势。

2.4 环介导等温扩增技术(LAMP)

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi[15]等在2000年开发的一种新型核酸恒温扩增方法,Lamp技术是在恒定的温度下,针对靶基因上的6个区域设计4条引物,在DNA聚合酶作用下进行扩增反应。Lamp在恒定温度下,不到1h就能达到109～1010倍的扩增,具有特异性强,灵敏度高,操作简单等特点,被广泛应用于细菌、病毒病原体、真菌病原体检测等方面[16-17]。金雪花[18]等人针对副溶血性弧菌tlh基因用EMA-LAMP法检测、鉴别副溶血弧菌死/活细菌。实验得出抑制细菌死细胞LAMP扩增的EMA最小浓度为8.0μg/mL。EMA-LAMP方法检测副溶血的检出限为1.0×102cfu/mL。实验可以有效的检测出副溶血弧菌的死/活细胞。但实验中EMA达到一定浓度时也会对活细胞产生毒副作用,因此实验中要注意EMA的用量,同时还要控制温度和曝光时间。Yamazaki[19]等人检验171份海产品样品副溶血弧菌污染情况,利用碱性蛋白胨富集海产品中的副溶血弧菌,针对副溶血弧菌的tlh基因设计特异性引物。结果表明lamp方法灵敏度和特异性分别达到100%和90.8%,比传统方法检出率更高,适用性更强。Prompamorn[20]等人应用LAMP-LFD方法快速检测副溶血弧菌,用LAMP方法结合FITE核酸检测侧向层析试纸,对副溶血的tlh基因设计引物。纯培养物灵敏度为120 cfu/mL,比常规PCR检出限少一个数量级。LAMP技术不需要特殊的仪器,适用于现场操作,但实验在常温下进行,操作时容易被污染,同时食品中的钙离子和血液等也会影响鉴定结果,可通过精细处理样品、操作时避免气溶胶产生、分装试剂、加热、添加Sybr greenI染色剂等方法提高准确性减少假阴性。LAMP结果可以通过肉眼观察沉淀,但是并不是特别明显,现多在反应前后添加指示剂来判断反应结果,已有Sybr greenI、钙黄绿素、羟基萘酚蓝和罗丹明 B 衍生物等指示剂。

2.5 原位荧光恒温核酸扩增方法(In Situ LAMP)

原位荧光恒温核酸扩增方法(fluorescence in situ loop-mediated isothermal amplification),结合了原位杂交和LAMP技术,可以检测单拷贝基因,省略提取DNA等步骤,反应温度低,结果较易观察[21]。Fumito[22]等人首先将该技术用于大肠杆菌O157∶H7的定性和定量检测中。Wang[23]等人应用原位荧光恒温扩增法检测活的非可培养状态的副溶血弧菌,以thl为目的基因设计引物,对副溶血弧菌、溶藻弧菌和人工污染样品进行原位荧光扩增,使用PCR、LAMP和in suit LAMP方法对市售水产品进行检测。in suit LAMP实验特异性强,可有效检测出副溶血弧菌。最低检出限低于其他检测方法,可以达到检测出单个细菌。实验不受其他杂质的影响,人工污染样品检出率可以达到96%以上。但是,in suit LAMP在用于不同细菌时候,由于细菌结构复杂,在处理细胞壁通透性时需要用特异的方法进行处理,否则不利于核酸扩增反应进行和避免扩增后的产物流出。

2.6 基因芯片

基因芯片,又称DNA微阵列(DNA microarray),最早是由Southern[24]在1989年提出的。基因芯片是把大量已知序列基因探针有序的、高密度的集成在同一玻片上,经过标记的若干靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针杂交,通过检测杂交信号,对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析[25]。韩海红[26]等人研制副溶血弧菌全基因组芯片,挑选出4770条基因,对各基因经行PCR扩增,点样法制备芯片,经PCR法确定准确性,成功的研制了一批质量良好的副溶血弧菌全基因组DNA芯片。王军[27]等人根据临床疾病表现的特点进行组合,设计特异性引物及探针,制备DNA芯片,运用多重PCR和基因芯片技术一次检测腹泻病粪便同一标本中7种常见致病菌。64份样本中检测出45份致病菌,其中12份为副溶血弧菌,副溶血弧菌检出限最低达到10cfu/mL。基因芯片从20世纪90年代发展至今,尤其高通量、检测速度快、准确性高、特异性强、有多色荧光标记、自动化程度高等特点在生物研究领域发挥重大作用。但是该技术也存在一些问题,制作成本高,芯片的制作和检测都需要价格高傲的设备和复杂的制作过程,对致病微生物基因序列信息的匮乏,芯片的质量等。未来基因芯片将沿着提高探针阵列的集成度和稳定性,降低成本,与其它技术结合使用,和生物信息学联合发展等方向,将此技术扩展到生命科学研究的各个领域,成为在商业化快速检测重要手段。

3 免疫学检测方法

3.1 酶联免疫吸附(ELISA)法

ELISA具有特异性强、仪器设备简单、低成本、试剂可长时间保存、无放射性同位素污染等特点。多被用于病原微生物、转基因食品、农兽药残留检测[28]。李国[29]等人从文蛤中分离出副溶血弧菌制备血清,用辣根过氧化物酶标羊抗兔血清为酶标二抗,对副溶血进行间接ELISA检测,检测结果灵敏度较低。何彬斌[30]分离纯化抗副溶血弧菌鸡卵黄免疫球蛋白建立的间接ELISA方法,一抗的最佳工作质量浓度为15lg/mL,二抗的最佳稀释度为1/10000,副溶血弧菌纯培养液的检出限为1.0×105cfu/mL,实验结果有较强的特异性,能够确切地对副溶血弧菌进行检测。ELISA 不可避免地存在着一些缺陷,如对试剂的选择性高、对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应,分析低分子量或不稳定的化合物有一定的困难等,但与其它检手段联合使用,如色谱、气相色谱质谱联用、电化学方法等,既可增加检测的灵敏度又可降低交叉反应,更准确地定量。

3.2 免疫胶体金技术(ICG)

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold tech-nique),是以胶体金为标记物,利用特异性抗原抗体反应,在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。胶体金制备简单、价低、可用于常规光镜和荧光显微镜、结果直观、可较长时间保存、对仪器要求低等特点[31]。杨靖亚[32]利用双抗体夹心法开发斑点免疫胶体金渗滤测试盒,能准确的检测副溶血弧菌tdh基因,其最低检测限达到250μg/mL。检测结果可在4℃条件下保存12周,其准确性和稳定性均未发生较大的改变。王报贵[33]等人对胶体金免疫试纸条进行改进,改进后的试纸条具有较好的特异性及灵敏度,在15min内就可以完成检测。但是,免疫胶体金实验容易被温度和杂质影响,假阴性率较高。可以采用信号放大系统如生物素-亲和素系统,在同一膜上作多种项目测定和多项目的组合测定,应用TROPT检测光密度等方法来提高免疫胶体金检测的敏感性、特异性、实现多元检测。

4 利用噬菌体及其在副溶血弧菌快速检测中的初步应用

Peng[34]等人利用噬菌体的高度专一性特点,从副溶血弧菌分离得到噬菌体,找出理想的噬菌体(副溶血弧菌p1)。用副溶血弧菌p1结合细菌荧光素酶-FMN和NADH氧化还原酶经行体外发光体系对副溶血弧菌的定量检测。检测副溶血弧菌回收率可以达到95%以上,重复实验偏差小于1,整个检测过程在4.5h之内可以完成。该方法准确度、复性、精密度和时短都达到较高的要求,适用于现代快速检测。但是,由于VP菌噬菌体裂解谱均比较窄,应用范围有限,可通过分子生物学方法改造噬菌体的基因组,或者通过将不同裂解谱的噬菌体混合使用,以扩大裂解谱的范围使其更适用于现代化检测。

5 变性高效液相色谱检测技术

变性高效液相色谱检测技术(denaturing high performance liquid chromatography),是由聚合酶链式反应结合变性高效液相色谱的技术。廖亮[35]等人利用DHPLC在非变性温度下进行双链DNA分离的原理及DHPLC技术分析副溶血弧菌特异性PCR扩增产物,检测结果可观。DHPLC可以多次测量多个样品并可避免单独PCR反应后期易污染等特点。

6 前景和展望

副溶血弧菌的传统国标检测方法要经过基础的分离、增菌、镜检和生化鉴定等繁琐步骤,现代进出口食品中副溶血弧菌标准检测方法常有实时荧光PCR、LAMP和MPCR-DHPLC法等,并结合传统方法进行鉴定。此外目前还有吖啶、橙染色法、高通量微生物鉴定仪、蛋白芯片法和电化学免疫传感器等在实验室使用的检测技术。现代分子生物技术因快速、准确、操作简便等特点已经逐步进入市场并占有主流地位。但是,每种方法都有自己的优势和劣势,各项技术的优化和搭配使用是我们要在现有的基础上努力的方向。如LAMP技术与生物传感器技术相结合,酶联免疫磁珠技术与PCR技术相结合。基因芯片技术融合了PCR、纳米芯片和探针杂交。可以同时检测多种致病菌,达到高效、准确等特点,适用于现代检测快速和高通量的要求,具有广泛的应用空间。

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Advancement of detection techniques forVibrioparahaemolytiousin aquatic products

JI Yi-fang1,HU Wen-zhong2,*,Jiang Ai-li2,FENG Ke3,DONG Yan1

(1.College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

Vibrioparahae-molytiousis one of the most frequent causes of death as food-borne pathogens in food. It infects the seafood products mostly and when people eat the seafood which is contaminated byVibrioParahaemolytcus,it will cause acute gastroenteritis,such as diarrhea,vomiting,abdominal eramps and so on. Molecular biological and immunological methods of the detection forVibrioParahaemolytcusand prospect the development direction of this field were summarized.

V.parahaemolyticus;detection

2014-05-13

纪懿芳(1989-),女,在读硕士,研究方向:食品科学。

*通讯作者:胡文忠(1959-),男,博士，教授,研究方向:食品科学。

国家自然科学基金项目(31172009);国家科技支撑计划项目(2012BAD38B05);大连市金州新区科技计划项目(2012-A1-049)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)05-0365-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.069