苟体忠，唐文华，任永权，孙大方，许西华

(1.凯里学院化学与材料工程学院,贵州凯里 556011;2.凯里学院富硒中草药研究中心,贵州凯里 556011;3.凯里学院应用化学研究所,贵州凯里 556011;4.环境与生命科学学院,贵州凯里 556011)



石吊兰总多酚体外抗氧化活性研究

苟体忠1,2,3，唐文华1,3，任永权4，孙大方1，许西华1

(1.凯里学院化学与材料工程学院,贵州凯里 556011;2.凯里学院富硒中草药研究中心,贵州凯里 556011;3.凯里学院应用化学研究所,贵州凯里 556011;4.环境与生命科学学院,贵州凯里 556011)

研究石吊兰总多酚的体外抗氧化活性。采用单因素实验研究提取时间、超声波功率、提取温度、乙醇浓度、提取次数和料液比对总多酚提取率的影响。用还原能力、·OH 清除率、DPPH·清除率来考察石吊兰总多酚的体外抗氧化活性。结果表明,超声提取石吊兰总多酚的最佳工艺条件为:提取时间32min,超声波功率为100%,提取温度为25℃,乙醇浓度为80%,提取次数为3次,液料比为20∶1,此时石吊兰总多酚得率为14.0mg GAE/g。此外,石吊兰总多酚的还原能力、对·OH以及DPPH· 的清除均高于VC。石吊兰总多酚是天然的抗氧化活性剂和自由基清除剂。

石吊兰,总多酚,抗氧化活性

石吊兰为苦苣苔科(Gesneriacee)吊石苣苔属植物吊石苣苔(Lveicnotus pauciflorus Maximl)的全草[1],又名石豇豆、石泽兰、岩豇豆等,具有清肺止咳、凉血止血、祛湿化滞、通络止痛之功效。石吊兰主要分布于贵州、云南、四川、江苏、广西等地。前人已对石吊兰进行了一系列研究,并得出了以下结论:石吊兰醇提液对S180 实体瘤有一定的抑瘤作用,其抑瘤率为42.1%[2];石吊兰中的石吊兰素是治疗结核病的有效成分[3];首次从石吊兰全草中分离出新的菖蒲烷类倍半萜类化合物3,10-dihydroxyacoronene[4];石吊兰中含有生物碱、黄酮类化合物、石吊兰素和B-谷甾醇等化合物[5]。

总多酚是多羟基酚类化合物的总称,具有抗癌、抗病毒、抗氧化等生物活性[6-9]。抗氧化性是植物总多酚的一个重要性质,其抗氧化活性能力与多酚类物质的含量及种类有关[8]。总多酚通过提供质子,消除自由基,自身形成稳定的共振结构而阻断氧化产生抗氧化作用,是医药、食品、化妆品中很有前景的一类天然抗氧化剂[9]。目前,石吊兰总多酚抗氧化活性的研究尚未见报道。因此,本文采用还原能力、羟基自由基清除率和DPPH自由基清除率来考查石吊兰总多酚的抗氧化活性,从而为石吊兰的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石吊兰于2013年10月采自凯里市雷公山,经凯里学院植物学博士鉴定为苦苣苔科(Gesneriacee)吊石苣苔属植物吊石苣苔(Lveicnotus pauciflorus Maxim1)的全草。

三氯乙酸、没食子酸、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、Folin&ciocalteu’s 酚试剂为aladdin试剂。其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计 UV-2550,岛津;植物粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司;水浴振荡器 SHA-C型,巩义予华仪器有限公司;超声波 WH-300,济宁万和超声电子设备有限公司;低速离心机TD5M,长沙湘智离心机仪器有限公司;电子天平 上海衡平仪器仪表厂。

1.3 分析方法

1.3.1 样品处理 石吊兰样品于80 ℃烘箱中干燥,再用植物粉碎机粉碎并过80目筛,待用。

1.3.2 提取时间选择 分别准确称取1.0g石吊兰粉末样品于5个50mL离心管中,在料液比为1∶20、乙醇浓度为80%、提取次数为2次、超声波功率为100%和提取温度为30℃的条件下,分别超声提取4、8、16、32、64min,离心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法测定其总多酚的含量。

1.3.3 超声波功率的选择 分别准确称取1.0g石吊兰粉末样品于5个50mL离心管中,在料液比为1∶20、乙醇浓度为80%、提取次数为2次、提取温度为30℃和提取时间为32min的条件下,分别以40%、50%、60%、80%、100%的超声波功率提取总多酚,离心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法测定其总多酚的含量。

1.3.4 提取温度的选择 分别准确称取1.0g石吊兰粉末样品于5个50mL离心管中,并在料液比为1∶20、乙醇浓度为80%、提取次数为2次、超声波功率为100%、提取时间为32min的条件下,分别以20、40、60、80、100℃水温提取总多酚,离心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法测定其总多酚的含量。

1.3.5 乙醇浓度的选择 分别准确称取1.0g石吊兰粉末样品于8个50mL离心管中,并在料液比为1∶20、提取次数为2次、超声波功率为100%、提取温度为30℃和提取时间为32min的条件下,分别用 30%、40%、50、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液提取总多酚,离心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法测定其总多酚的含量。

1.3.6 提取次数对石吊兰总多酚含量的影响 分别准确称取1.0g石吊兰粉末样品于5个50mL离心管中,并在料液比为1∶20、超声波功率为100%、乙醇浓度为80%、提取温度为30℃和提取时间为32min的条件下,分1、2、3、4、5次提取总多酚,离心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法测定其总多酚的含量。

1.3.7 料液比的选择 分别准确称取1.0g石吊兰粉末样品于5个50mL离心管中,并在超声波功率为100%、乙醇浓度为80%、提取温度为30℃、提取次数为3次和提取时间为32min的条件下,分别用料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50提取总多酚,离心,合并提取液于50mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液定容至刻度,并按1.3.8的方法测定其总多酚的含量。

1.3.8 总多酚测定 总多酚含量的测定参照文献[10]并稍作修改。其简要流程为:准确称取0.125 g没食子酸用超纯水定容至1000mL。分别吸取该标准溶液0、1、2、3、4、5mL于6个25mL比色管中,先加超纯水至10mL,摇匀,再加入Folin-Ciocalteu(FC)酚试剂1.0mL,混匀,然后加入6.0mL 10%Na2C03溶液,并用超纯水定溶至刻度,摇匀。然后在暗室中放置2h,并于760nm波长下测定其吸光度。以没食子酸浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,其回归方程为:A=0.0838C+0.0067(r=0.9999)。取石吊兰提取液0.2mL于25mL比色管中,按上述步骤测定其吸光度,再根据回归方程计算石吊兰提取液总多酚的浓度,并以此计算其多酚含量,以每克样品中没食子酸当量表示(mg GAE/g)。

1.3.9 醇提物还原能力测定 还原能力的测定方法参照文献[11],其简要流程为:取1mL不同浓度的提取液,并依次加入2.5mL的 pH6.6 的磷酸盐缓冲液和1%(m/v)铁氰化钾(K3Fe(CN)6)溶液,摇匀并置于50℃水浴振荡器中振荡20min。然后加入2.5mL 10%(m/v)三氯乙酸溶液,摇匀并取混液 2.5mL,再加入2.5mL 超纯水以及0.1%(m/v)氯化铁溶液,摇匀并静置10min,在 700nm处测定吸光度(As),以超纯水代替提取液作为空白并测定其吸光度 Ac。则还原能力可以用ΔA来表示(ΔA=As-Ac),其值越大,提取液还原能力越强。

1.3.10 ·OH清除率的测定 ·OH清除率的测定方法参照文献[11],其简要流程为:在25 mL比色管中依次加入4mL pH7.4磷酸钠缓冲液以及1.5mL 5mmol/L邻二氮菲溶液、1mL 7.5mmol/L FeSO4溶液、1.5mL双蒸水,摇匀,再加入1mL不同浓度的提取液,立即摇匀。然后加入1mL 1%(v/v)H2O2溶液,摇匀并置于37℃恒温水浴中恒温60min。最后,在536nm处测定其吸光度。根据下式计算样品对·OH清除率:

·OH清除率(%)=[(A1-A2)/(A0-A2)]×100

其中:A1为加入提取液及H2O2时测得的吸光度;A2为加 H2O2而不加提取液时测得的吸光度;A0为不加提取液及 H2O2时测得的吸光度。

1.3.11 DPPH·清除率测定 DPPH·清除率的测定方法参照文献[12],其简要流程为:在25mL比色管中依次加入2mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液和2mL不同浓度的提取液,摇匀,并在暗室中放置30min,以无水乙醇为参比液,在517nm下测定其吸光值As,同时测定2mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液与2mL无水乙醇混合液的吸光值Ac。根据下式计算样品溶液对DPPH·的清除率:

DPPH·清除率(%)=(1-As/Ac)×100

1.3.12 数据处理方法 文中数据和图表分别采用Excel、coreldraw12软件处理。

2 结果与讨论

2.1 石吊兰不同极性试剂提取液清除DPPH·的能力

从图1可见,石吊兰不同极性试剂提取液对DPPH·的清除能力存在明显差异,其大小顺序为:乙醇>正丁醇>乙酸乙酯>甲醇>水>石油醚。由此可知,乙醇提取液具有较高的清除DPPH·的能力。因此,以下实验均以乙醇提取液为考察对象。

2.2 石吊兰总多酚提取条件的优化

2.2.1 提取时间对石吊兰总多酚含量的影响 从图2A可见,随着超声时间的增加,其总多酚含量增加,当超声时间为32min时,其总多酚含量达到最大值。

图1 不同提取液对DPPH·清除率的影响Fig.1 Effection of the different extraction solution on DPPH· scavenging rate

2.2.2 超声波功率对石吊兰总多酚含量的影响 从图2B可见,随着超声波功率的增加,其总多酚含量增加,当超声波功率为100%时,其总多酚含量达到最大值。

2.2.3 提取温度对石吊兰总多酚含量的影响 从图2C可见,在20～80℃的水温条件下,石吊兰总多酚含量几乎保持不变。分析认为,提取水温对石吊兰总多酚的含量影响不显著,只需在室温(25℃)下提取即可。

2.2.4 乙醇浓度对石吊兰总多酚含量的影响 从图2D可见,随着乙醇浓度的增加,其总多酚含量增加,当乙醇浓度为80%时,其总多酚含量达到最大值。

2.2.5 提取次数对石吊兰总多酚含量的影响 从图2E可见,随着乙醇浓度提取的增加,其总多酚含量增加,当提取次数为3次时,其总多酚含量达到最大值且开始保持不变。

通过不断地实践与改革，得到了较好的结果。《临床血液学检验技术》的教学改革多次被领导提及，并受到了学生们的一致好评，同学们的综合成绩也有所上升。

2.2.6 料液比对石吊兰总多酚含量的影响 从图2F可见,随着料液比的增加,其总多酚含量有所增加,当料液比达到1∶20时,其总多酚含量达到最大值,并保持恒定值。

2.3 石吊兰总多酚含量

取石吊兰乙醇提取液,在波长760nm处测定其吸光度,代入1.3.8的回归方程计算其多酚含量为14.0mg GAE/g。

2.4 石吊兰总多酚的还原能力

以VC为对照样品,分别测定石吊兰总多酚和VC的还原能力。经相关分析表明,石吊兰总多酚和VC与还原能力之间存在明显的正相关关系(其相关系数分别为0.9774和0.9944)。分析认为,石吊兰中抗氧化活性成分可能是有总多酚含量决定的。国外学者研究也表明,含有高水平总多酚的植物表现出很好的体外抗氧化活性[13]。从图3可见,随着浓度的的增加石吊兰总多酚以及VC还原能力增加,且石吊兰总多酚的还原能力略高于VC。研究表明,石吊兰多酚具有较强的还原能力。

图2 提取条件对石吊兰总多酚含量的影响Fig.2 Effect of extraction conditions on content of total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl

图3 不同浓度石吊兰总多酚对还原能力的影响Fig.3 Effect of the different concentration on reducing power from Lveicnotus pauciflorus Maximl

2.5 石吊兰总多酚清除·OH的能力

以VC为对照样品,分别测定石吊兰总多酚和VC清除·OH的能力。经相关分析表明,石吊兰总多酚与VC对·OH的清除率之间存在明显正相关关系(其相关系数分别为0.9999和0.9241)。分析认为,石吊兰醇提物清除·OH的活性主要是由总多酚成分决定的。由图4可见,石吊兰总多酚对·OH的清除能力高于VC,这表明石吊兰总多酚具有较好的清除·OH的能力。

图4 不同浓度石吊兰总多酚对 ·OH清除率的影响Fig.4 Effect of the different concentration on OH· scavenging rate from Lveicnotus pauciflorus Maximl

以石吊兰总多酚和VC浓度(X)对·OH的清除率(Y)作回归分析。石吊兰总多酚对·OH的清除率的回归方程为:Y=0.0865X+2.9626(r=0.9999)。VC对·OH的清除率的回归方程为Y=0.0054X+2.787(r=0.9241)。分析结果表明,石吊兰总多酚清除·OH的活性远大于VC。

2.6 石吊兰总多酚清除DPPH·的能力

以VC为对照样品,分别测定石吊兰总多酚和VC清除DPPH·的能力。经相关分析表明,石吊兰总多酚对DPPH·和VC的清除率之间呈明显正相关(其相关系数分别为0.9996和0.9989)。分析认为,石吊兰醇提物清除DPPH·的活性可能主要是由总多酚成分决定的。由图5可见,随着石吊总兰总多酚和VC浓度的增加,其清除DPPH·的活性增加。分析认为,石吊兰总多酚具有很好的清除DPPH·的能力。

图5 不同浓度石吊兰总多酚对DPPH·清除率的影响Fig.5 Effect of the different concentration on DPPH· scavenging rate from Lveicnotus pauciflorus Maximl

以石吊兰总多酚和VC浓度(X)对DPPH·的清除率(Y)作回归分析。石吊兰总多酚对DPPH·的清除率的回归方程为:Y=3.0136X+0.8166(r=0.9989)。VC对DPPH·的清除率的回归方程为Y=2.7698X+1.3694(r=0.9996)。分析结果表明,石吊兰总多酚清除DPPH·的能力稍强于VC。

3 结论

研究表明,超声提取石吊兰总多酚的最佳工艺条件为:提取时间为32min,超声波功率为100%,提取温度为25℃,乙醇浓度为80%,提取次数为3次,液料比为20∶1,此时石吊兰总多酚得率为14.0 mg GAE/g。此外,通过对石吊兰总多酚的还原能力、DPPH·清除率、·OH清除率的分析结果表明,石吊兰总多酚具有较强的还原能力,较高的·OH清除能力,以及较强的DPPH·清除能力。分析认为,石吊兰总多酚具有较强的体外还原活性,是天然的抗氧化活性剂。

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Study on antioxidant activityinvitroof total polyphenolfrom Lveicnotus pauciflorus Maximl

GOU Ti-zhong1,2,3，TANG Wen-hua1,3，REN Yong-quan4，SUN Da-fang1，XU Xi-hua1

(1.Institute of Chemistry & Materials Engineering,Kaili University,Kaili 556011,China;2.Research center of selenium-riched Chinese Herbs,Kaili University,Kaili 556011,China;3.Institute of Applied Chemistry,Kaili University,Kaili 556011,China;4.Institute of Environment and Life Science,Kaili University,Kaili 556011,China)

To study the antioxidant activityinvitroof total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl.The single factor was taken to study the effects of extraction time,ultrasonic power,extraction temperature,extraction times,and ethanol concentration liquid-material ratio on the extraction rate of total polyphenol.The antioxidant activityinvitroof total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl was evaluated by reducing power,hydroxyl and DPPH free radical scavenging effect.The results showed that the optimum conditions for extracting the polysaccharides assisted by ultrasonic wave were as follows:extraction time 32min,ultrasonic power 100%,extraction temperature 25℃,extraction times 3,and ethanol concentration liquid-material ratio 20∶1,and the extraction rate of total polyphenol was up to 14.0mg GAE/g.In addition,the reducing power of total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl was more than VC,and the scavenging ability of DPPH· and ·OH was also stronger than VC.Total polyphenol from Lveicnotus pauciflorus Maximl is an effective and natural antioxidant and free radical scavenger.

Lveicnotus pauciflorus Maximl;total polyphenol;antioxidant activity

2014-06-12

苟体忠(1981-)，男，博士，副教授，从事天然药物化学研究。

国家青年自然科学基金(41303016)；贵州省科技厅自然科学基金(黔科合J字[2011]2079号)；凯里学院博士专项基金(BS201003)；贵州省高校优秀科技创新人才计划项目(黔教合KY字[2012]099号)；贵州省教育厅“高层次人才引进项目”(院科通[2012]7号)；凯里学院重点项目(Z1202)；贵州省特色重点学科资助项目(黔教高发[2011]208号)；凯里学院重点学科资助项目(院通字[2010]86号)；贵州省优秀科技人才省长基金项目(黔省专合字[2011]77号)；凯里学院分析化学重点学科(院通字[2014]157号)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)05-0073-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.006