李颖超,钱 和,孙秀兰,汪何雅,崔 燕,杜 超,夏秀华

(江南大学食品科学与工程学院,江苏无锡 214122)



典型热加工对花生致敏蛋白及其免疫反应性的影响

李颖超,钱 和*,孙秀兰,汪何雅,崔 燕,杜 超,夏秀华

(江南大学食品科学与工程学院,江苏无锡 214122)

通过免疫学方法检测了花生制品加工过程中几种典型热加工方式对花生致敏蛋白的免疫反应性的影响。结果表明:烘焙、水煮、油炸和高温高压处理均使花生可溶性蛋白含量显著降低;随之,处理后样品中蛋白提取物的免疫反应性也显著下降,其中高温高压处理最为显著;热处理对花生致敏蛋白Ara h 2的溶解性及免疫反应性的影响较小,而对Ara h1和Ara h 3的影响则比较明显。

花生,过敏,致敏蛋白,免疫反应性

花生是世界卫生组织公布的8大食物致敏原之一,其引起过敏反应的最小剂量非常低,安全剂量仅为0.1mg,是蛋和奶的1/30,大豆的1/4000。另外,与蛋和奶等过敏原不同,花生过敏往往伴随终生[1]。加拿大一项大型调查显示,成人诊断明确的花生过敏率为1%,另有0.93%的调查对象为疑似对象[2]。在我国,一项针对青岛市过敏性疾病儿童的过敏原构成研究显示,超过40%的过敏体质儿童对花生过敏[3]。在食物过敏引起的死亡病例中,过半是由花生引起。然而,花生又是一种营养丰富、具有香溢口感的大宗食品,它作为原料或配料广泛用于生产各种加工食品。在花生的加工和烹调过程中,常常用到高温加热工艺,如水煮、烘烤、油炸、杀菌等。自1925年发现第一例花生过敏病例以来,已有几十种花生蛋白被指与花生导致的过敏有关,但其中有11种(Ara h 1～11)被普遍认可并正式命名[4]。这些致敏蛋白大多(Ara h 1～4,6,7)属于种子贮藏蛋白,其中Ara h 1和 Ara h 2是主要致敏蛋白,能被95%的花生过敏患者血清所识别[5]。这些蛋白在食物的加工过程中会发生结构的变化,如展开、聚集,以及化学修饰。这些变化导致花生致敏性的变化。目前,国内有关加工方式对花生致敏性的研究十分鲜见。因此,本文将通过免疫学方法,对典型热加工方式对花生致敏蛋白组分及其免疫反应性的影响做初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

C3H/HeJ小鼠(五周龄) 上海斯莱克实验动物有限公司;霍乱毒素(CT) Sigma;花生(红皮) 购于无锡市区超市;醋酸纤维膜(1.2μm) 德国Sartorius;TMB/DAB显色液 上海生物工程有限公司;96孔聚苯乙烯酶标板 Costar;HRP标记羊抗鼠IgE Southern Biotech 美国;蛋白质定量检测试剂盒 上海生物工程有限公司;其它常规试剂 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生过敏小鼠模型的建立与血清的保存 方法参考文献[6]，致敏:花生研磨成浆与CT混合,每只小鼠灌胃剂量为15mg花生(PN)与10μg CT;在第1、2、3d用花生浆液于CT的混合液连续灌胃3天,之后同样配方灌胃,每周一次,连续3周。激发:最后一次致敏后一周,小鼠空腹过夜,花生浆灌胃激发。灌胃剂量为每只小鼠30mg PN,分两次灌胃。共设3组:空白组:蒸馏水;对照组:10μg CT;过敏组:15mg PN+10μg CT。激发后通过摘眼球取血获得过敏小鼠血液,常温下放置3 h后,4000×g离心10 min,血清析出,分装后于超低温冰箱(-76℃)保存。

1.2.2 花生的加热处理 油炸(YZ):160℃花生油油炸5min;烘焙(HB):鼓风干燥箱160℃,40min;水煮(SZ):100℃沸水20min;高温高压(GG):121℃,0.1MPa,30min。处理后将潮湿的样品在30℃下干燥,水分含量低于6.0%。样品置于-20℃保存。

1.2.3 花生总蛋白(PE)的浸提液的制备 选新鲜优质的花生仁,揉搓去除红衣后在组织捣碎机中粉碎,过40目筛。再将花生粉与正己烷按1∶10(g/mL)混合,在4℃下磁力搅拌脱脂2h,静置1h,弃去上清液,重复脱脂一次。将脱脂花生粉在通风橱中放置过夜,使正己烷挥发干净。将脱脂后花生粉与预冷的0.01mol/L PBS(pH7.4,含0.01mol/L β-巯基乙醇和0.05% EDTA·2Na)1∶10(g/mL)混合,4℃下磁力搅拌过夜。次日将浸提液在4℃,11000×g离心30min,收集上清液,沉淀用浸提液再提取4h,离心后合并上清液,分装后保存在超低温冰箱(-76℃)。

1.2.4 样品中可溶性蛋白的提取及其含量的测定 称取干物质量为0.5g的样品,加入0.01mol/L PBS(pH 7.4,含0.01mol/L β-巯基乙醇和0.05% EDTA·2Na)1∶10研磨浸提,在4℃下11000×g离心30min,收集上清液待用。将上清液梯度稀释后按照说明书(蛋白质定量检测试剂盒)操作。

1.2.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 本实验采用不连续体系SDS-PAGE垂直平板凝胶电泳,浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为12.5%,浓缩胶内的电压为80V,分离胶内的电压为120V。电泳后,考马斯亮蓝R-250染色、甲醇-冰醋酸脱色、凝胶成像得到电泳结果。低分子量标准蛋白分子量为14.4～97.4ku。样品上清液与上样缓冲液1∶4混合煮沸3～5min,上样量为10μL。

为了调查油田方言的调值和历史演变，采访了三名不同年龄段的被试，三人都为本地常住居民，皆没有长期离开居住地；年龄差异较明显，三人的发音器官健康正常，没有影响发音的缺陷，因此能够代表油田话的发音人。表2是三位被试的具体信息。

1.2.6 免疫印迹(Western blotting)

1.2.6.1 电泳 SDS-PAGE电泳后,凝胶不染色,放入转移缓冲液中平衡至少5min。

1.2.6.2 转膜(半干法) NC膜、滤纸和无纺纤维垫在转移缓冲液中浸泡20min,从阴极到阳极,依次放置无纺纤维垫、三层滤纸、凝胶、NC膜、三层滤纸、无纺纤维垫,制作“三明治”电转芯,期间用玻璃棒赶走气泡,将其放入转印槽,200mA转膜70min。

1.2.6.3 封闭 转膜结束后,37℃下TBS漂洗3次,每次5min。漂洗后,加入封闭液,4℃过夜。

1.2.6.4 加一抗 TBST漂洗3次,每次5min。加入一抗(1∶10,过敏小鼠血清),在37℃孵育3h。

1.2.6.5 加二抗 TBST漂洗3次,每次5min,加入二抗(1∶2500,HRP标记羊抗鼠IgE),37℃孵育2h;

1.2.7 间接竞争ELISA 1μg/mL的PE在4℃下包被过夜,洗涤后加入一抗(1∶10,过敏小鼠血清)与待测样品液(稀释3倍)的混合物(1∶1),37℃孵育1h孵育。再次洗涤3次,加入二抗(1∶2500,HRP标记羊抗鼠IgE)37℃孵育1h孵育。再洗涤4次后,加入TMB显色液,37℃孵育0.5h孵育。之后加入1mol/L的硫酸溶液终止反应,37℃孵育15min后立即在450nm下测定吸光度值。

1.2.8 数据分析 采用EXCEL2003进行均值和标准差计算,结果以“均数±标准差”表示,并采用SPSS13.0进行Doucan’s多重检验(p<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 可溶性蛋白含量

由图1可见,热加工处理后的花生仁,其SPE的含量均显著降低。烘焙处理和高温高压处理后,样品中可溶性蛋白含量显著降低,仅为对照的40%～45%,同时这两个处理间无显著性差异。水煮和油炸处理后,样品中SPE含量的下降程度更大,仅为对照的23%～27%,且两处理间也无显著差异。热处理可使蛋白质结构发生显著的改变。当温度高于70～80℃时,其三级结构将发生不可逆的转变;当温度高于80～90℃时,蛋白质分子会发生分子内或分子间相互作用,以及二硫键的重排;当温度达到90～100℃时蛋白质分子就会发生聚集[7]。Schmitt等[8]同样水煮、油炸和烘焙花生后,其可溶性蛋白含量发生明显下降,且随着处理时间的延长下降程度越大。Mondulet等[9]也得到相似结果,且烘焙处理的花生中的SPE含量为总蛋白含量的60%,而水煮花生中SPE含量更低(约为总蛋白含量的30%)。丛艳君[10]等学者的研究结果则表明,花生中SPE的含量受到加工方式和提取缓冲液的影响,尿素溶液的提取率最高,磷酸缓冲液提取率也较高,而柠檬酸、醋酸缓冲液提取效率较低,主要受pH影响。目前,花生致敏性研究中大多用pH为7.4的磷酸缓冲液。一方面是致敏蛋白提取率较为理想,另一方面使其活性保持较好。而不同处理对可溶性蛋白含量的影响主要是由处理温度和时间的差异造成的。处理温度越高,时间越长,蛋白质发生变性和共价修饰的程度就高,其可溶性可能变化就越大。本研究中,油炸处理的温度很高,且这种加工方式的热传递速度很快,所以花生在较短时间就达到加工要求,严酷的处理条件是花生中可溶性蛋白含量显著降低的一个因素。另外,水煮处理后花生中SPE含量也很低,这主要是由于花生中部分蛋白转移到了处理水中,这在Schmitt 等和Mondulet 等的研究中都得以证实[8-9]。

图1 热加工处理对花生中可溶性蛋白含量的影响Fig.1 Effect of heat treatment on content of soluble proteins of peanut seeds

2.2 SDS-PAGE电泳

由图2可以看出，花生经热处理后，蛋白质提取物的电泳特征均发生了明显变化。首先，处理后样品蛋白提取物的电泳条带较对照浅，这说明处理后样品的蛋白提取物含量有所下降，这与可溶性蛋白含量的变化结果一致。其次，分子量大约在66、31～43、20ku左右的6个条带，不同处理的样品这些条带的变化不同。其中，烘焙和水煮样品66ku的条带较对照都明显变窄，而高温高压和油炸处理的样品该条带几乎看不到；油炸处理样品31～43ku之间分子量较大的条带与对照无明显差异，而其他处理样品该条带皆明显变浅；而31～43ku之间分子量较小的条带除在烘焙处理样品中有显现痕迹外，其他处理样品该条带均没有显现；烘焙和水煮样品中20ku左右的3个条带较对照均无明显变化，高温高压处理样品未形成明显条带，而油炸处理样品只剩其中较大和较小的2个条带，中间1条带消失。由此结果可得出，热加工处理对样品蛋白质提取物中20ku左右的低分子量蛋白的影响较小，而对66、31～43ku分子量较大的蛋白影响比较明显。这与其他研究学者的结果相似[8-9,11]。

图2 热加工处理后花生蛋白质提取物的 SDS-PAGE电泳图Fig.2 Electrophoretic pattern of the protein extracts from different heated peanuts

2.3 ELISA和Western blotting

致敏原蛋白与特异性IgE的结合能力,即其免疫反应性是反映致敏原蛋白激发能力的一个重要体外检测指标。本研究为了检测热加工处理后样品可溶性蛋白提取物的与花生致敏蛋白特异性IgE的结合能力的变化,用间接竞争ELISA和Western blotting两种方法从总IgE的结合能力和花生致敏原不同组分的IgE的结合能力进行了分析。热加工处理样品可溶性蛋白提取物的IgE的结合能力均显著低于对照,其中高温高压处理者最低(图3a)。然而,这种降低并不能说明加工一定会降低花生中致敏原蛋白的免疫反应性。因为,热加工处理使蛋白质变性,样品中可溶性蛋白含量降低。因此,本研究中处理后样品的抑制率下降很大一部分原因是蛋白质含量降低所致。国外大多学者研究表明,HB处理会增加花生的致敏性[9,11-12],并且认为这种增加与美拉德反应有密切关系[12-14]。同样,油炸花生也会发生美拉德反应[9]。相反,水煮与高温高压处理的样品,由于水的存在,美拉德反应较弱,而样品的免疫反应性也有所降低[8-9,11,15]。水煮处理之所以降低花生致敏性是由于一部分致敏原在水煮过程中转移到了处理用水中[10]。高温高压处理样品的IgE的结合能力的下降主要归因于致敏蛋白结构的改变,同时其致敏蛋白的消化稳定性的降低也为其致敏性的下降提供了可能[15]。高温高压降低致敏蛋白的免疫反应性的研究不仅仅局限于花生,在绿豌豆和羽扇豆的相关研究中也得到类似结果[16-18]。但是,高温高压处理并不能降低杏仁和桃子中致敏原蛋白的IgE的结合能力[19-20]。综上所述,湿热处理可通过移除致敏原或改变其构象而降低其免疫反应性,为致敏性的降低提供了极大空间。但也并不适用于任何致敏原蛋白,需要进行验证。

图3 热加工处理后花生蛋白质提取物的 ELISA结果(a)和West blotting(b)Fig.3 The ELISA(a)and Western blotting performed on the protein extracts(b) from different heated peanuts

Ara h1和Ara h2是最重要的两种致敏蛋白,其分子量分别为65和17～19ku,且前者占种子总蛋白的12%～16%左右[21]。Ara h 3也是一种比较重要的花生致敏原,其分子量在14～45ku[22]。本研究结果表明,热加工处理对Ara h2的影响较小,而Ara h 3与IgE的结合则大大减少或检测不到,尤其是高温高压处理后样品中分子量较大的蛋白在SDS-PAGE和Western blotting中均未检测到,同时油炸处理样品中Ara h1也几乎检测不到;而烘焙和水煮处理样品中Ara h1可明显检测到(图3b)。由此可见,热加工处理后,花生中可溶性蛋白提取物样品免疫反应性的变化主要是由于Ara h1和Ara h3数量和IgE的结合活性的变化引起。同时,高温高压处理是一种降低花生致敏性很具潜力的处理方法。

Beyer等认为[11],水煮和油炸花生中Ara h1的显著减少是样品IgE的结合能力下降的主要原因,也是中国花生过敏人口较少(以水煮和油炸为主要食用方式)的原因。然而,Cabanillas等研究发现[15],热处理后样品中不溶性蛋白质成分中致敏原含量很高。因此,目前的研究都是基于处理后可用缓冲液提取出来的部分蛋白质的理化和生物特性而进行的,而因为加工处理而变性的那一部分的性质无法得以表征。近期的一些研究中,也有对不溶性部分做研究的结果[8,15],然而用于电泳实验的上样缓冲液也并不能完全提取出所有致敏蛋白。因此,体外检测食品的致敏性,尤其是在定量方面,局限性较大,需要寻求更加全面和说服力的定量检测方法。

3 结论

热加工处理可显著影响花生蛋白提取物中致敏原蛋白的含量和特性。由于热变性花生提取物中致敏蛋白含量均显著下降,其中Ara h1和Ara h3的变化较大,而Ara h2相对稳定。水煮处理可使样品中较多致敏蛋白溶于处理用水而移除致敏原;高温高压处理则通过改变致敏蛋白构象,在降低花生致敏性方面具有一定潜力。

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Effect of thermal processing on the immunoreactive propertiesof allergenic proteins from peanut seeds

LI Ying-chao,QIAN He*,SUN Xiu-lan,WANG He-ya,CUI Yan,DU Chao,XIA Xiu-hua

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The aim of this study was to assess the effect of thermal processing on the IgE-binding capacity of whole peanut protein extracts. The results showed that:the content of soluble protein extracts was less marked in roasted,boiled,fried and autoclaved than in raw peanuts,and the IgE immunoreactivity of processed peanuts also decreased significantly,especially of autoclaved peanuts. The immunoreactive properties of allergens(Ara h1,Ara h2 and Ara h3)were altered by heat treatment and in particular of Ara h1and Ara h2.

peanut;allergy;allergenic protein;immunoreactivity

2014-05-14

李颖超(1984-),女,博士,研究方向:食品营养与安全。

*通讯作者:钱和(1962),女，博士，教授，研究方向：食品安全与质量控制。

国家科技支撑计划课题(2011BAK10B03);江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(1026010241120600)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)05-0095-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.011