陈 菲,张奉苏,刘训红,杨念云,侯 娅,马 阳

(南京中医药大学药学院,江苏南京 210023)



樟芝菌粉的氨基酸测定及营养评价

陈 菲,张奉苏,刘训红*,杨念云,侯 娅,马 阳

(南京中医药大学药学院,江苏南京 210023)

建立了柱前衍生化高效液相色谱(HPLC)测定樟芝菌粉中氨基酸含量的方法,并进行营养评价分析。样品以邻苯二甲醛(OPA)为衍生化试剂衍生后进行HPLC分析,色谱条件为:Thermo Hypersil GOLD Dim色谱柱(150mm×4.6mm,3μm),流动相A为20mmol/L醋酸钠∶0.3%四氢呋喃∶0.02%三乙胺(pH7.2),流动相B为100mmol/L醋酸钠∶甲醇∶乙腈(200∶450∶350),流速为1mL/min,检测波长为338.1nm;采用氨基酸比值系数法对樟芝菌粉进行营养评价。结果表明:樟芝菌粉中含有20种游离氨基酸、18种结合氨基酸,氨基酸的种类和含量丰富;菌粉中除苯丙氨酸+酪氨酸外,其余几种必需氨基酸均低于WHO/FAO模式谱,氨基酸配比合理性不高,菌粉中第一限制性氨基酸为蛋氨酸+半胱氨酸,樟芝菌粉含有γ-氨基丁酸,含量为1.57mg/g。

樟芝菌粉,氨基酸,柱前衍生高效液相色谱法,营养评价

樟芝Antrodiacamphorata(M.Zang & C.H. Su)Sheng H. Wu,Ryvarden & T.T. Chang为我国台湾特产真菌,仅生长于台湾保育类树种——牛樟树(Cinnamomum kanehirai Hay)上[1]。樟芝具有清热解毒、清肝泻火、消痈散结、利咽、散瘀止痛之功效[2]。目前,樟芝的研究多集中于樟芝发酵菌丝体。

氨基酸作为生物体内构成蛋白质分子的基本单位,是生物体内不可缺少的营养成分。食物中氨基酸的含量、种类及比例是评价其营养价值的主要指标之一。目前氨基酸的分析方法包括氨基酸自动分析仪[3],柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相色谱(HPLC)法[4-5],毛细管电泳法等[6],《食品中氨基酸的测定(GB/T 5009.124-2003)》规定了用氨基酸自动分析仪测定食物中16种氨基酸的方法[7]。柱前衍生HPLC法因具有分离度高、选择性好等优点,已成为氨基酸分离分析的有力工具[8]。邻苯二甲醛(OPA)因具有衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定等特点,而成为一种经典的氨基酸衍生试剂。本文在前期研究基础上[9-11],采用柱前衍生化高效液相色谱法分析不同批次、不同培植方法樟芝中游离氨基酸和结合氨基酸的组成及含量,同时进行营养评价分析,并与灵芝作比较,为樟芝菌粉的开发利用和品质评价进一步提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品S1～S10为台湾长庚生物科技股份有限公司提供的樟芝发酵菌粉,批号为:02L07,02L11,02L14,02L18,02L21,02L25,02L28,03L04,03L07,03L11;S11为台湾长庚生物科技股份有限公司提供的椴木栽培樟芝子实体;S12为收集于安徽亳州药材市场的灵芝(紫芝);天门冬氨酸(Asp,1)、谷氨酸(Glu,2)、丝氨酸(Ser,3)、组氨酸(His,4)、甘氨酸(Gly,5)、苏氨酸(Thr,6)、精氨酸(Arg,7)、丙氨酸(Ala,8)、酪氨酸(Tyr,9)、胱氨酸(Cys,10)、缬氨酸(Val,11)、蛋氨酸(Met,12)、苯丙氨酸(Phe,13)、异亮氨酸(Ile,14)、亮氨酸(Leu,15)、赖氨酸(Lys,16)、脯氨酸(Pro,17)、谷氨酰胺(Gln,18)、γ-氨基丁酸(GABA,19)、色氨酸(Trp,20)标准品 Agilent公司,纯度≥99%,浓度为1nmol/μL;乙腈 美国天地公司,色谱纯;工业高纯氮 上海比欧西气体工业有限公司;邻苯二甲醛(OPA)、盐酸、氢氧化钠等,分析纯;实验用水均为双重蒸馏水。

Agilent 1200高效液相色谱仪,包括G1315C系列DAD检测器 美国安捷伦;YP601N电子天平 上海精密科学仪器公司;DHG-9023电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏设备有限公司;KQ-500B超声波清洗机 昆山超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 游离氨基酸供试液的制备 精确称取S1～S12样品粉末(100目)干品1g,分别置于安瓿底部,加入6mL 80%乙醇溶液,放置过夜,次日超声处理20min,过滤,样品再依次用2mL 80%乙醇超声提取2次,每次10min,滤过,合并3次滤液置10mL容量瓶,加入80%乙醇稀释至刻度,即得游离氨基酸供试液。

1.2.2 酸水解液的制备 精密称取上述样品200mg,分别置于安瓿底部,加入6mol/L HCl(含1%苯酚)2mL,通氮气并迅速封管口,置110℃烘箱中水解24h,取出放冷至室温。打开管口,加碱中和至pH=7,过滤,将滤液定量转移至10mL容量瓶中[1],加蒸馏水稀释至刻度,即得酸水解液。

1.2.3 碱水解液的制备 精确称取上述干燥样品200mg,分别置于安瓿底部,加入5mol/L NaOH溶液2mL,通氮气并迅速封口,置110℃烘箱中水解24h,取出放冷至室温。打开管口,加酸中和至pH=7,过滤,将滤液定量转移至10mL容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,即得碱水解液(用于测定色氨酸)。

1.2.4 衍生化方法及测定方法 采用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生化方法[12]。色谱柱:Thermo Hypersil GOLD Dim(150mm×4.6mm,3μm);流动相A:20mmol/L醋酸钠∶0.3%四氢呋喃∶0.02%三乙胺(pH7.2);B相:100mmol/L醋酸钠∶甲醇∶乙腈(200∶450∶350);梯度:0～33min,B相从6升至47%;36～40min,B相到100%;流速:1mL/min;柱温:40℃;泵压:15～20Mpa;检测波长:338.1nm;进样量1μL。

1.2.5 样品分析 分别吸取各样品的游离氨基酸供试液和酸、碱水解液,在相同的色谱条件下进样测定,以保留时间定性,以计算机自动分析定量,得到各氨基酸的含量结果。其中游离氨基酸供试液测得结果即为样品中游离氨基酸含量;酸、碱水解液测得结果为样品中总氨基酸含量;样品中结合氨基酸含量=总氨基酸含量-游离氨基酸含量。

1.3 营养评价

利用年世界卫生组织/联合国粮农组织(WHO/FAO)1973年修正的理想蛋白质人体必需氨基酸模式谱,计算上述样品中必需氨基酸(EAA)的氨基酸比值(RAA),氨基酸比值系数(RC)及比值系数分(SRC)[13]。

RAA=(待评蛋白质EAA含量)/(模式谱中相应EAA含量)

RC=(RAA)/(RAA的平均值)

SRC=100-CV×100,式中:CV为RC的变异系数;CV=标准差/均值。

其中RAA表明样品蛋白质中某种EAA含量是WHO/FAO模式谱中相应EAA倍数;RAA和RC越接近1,表明该氨基酸越接近WHO/FAO模式谱,RC>1表明该种必需氨基酸相对过剩,RC<1表明该氨基酸相对不足;RC最小者则为第一限制性氨基酸;SRC越接近100,营养价值越高,SRC越小,营养价值越低。

1.4 数据统计分析

利用Excel对不同批次樟芝菌粉中游离氨基酸及结合氨基酸的含量进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 樟芝菌粉中游离氨基酸分析

以标准氨基酸溶液为对照品,上述样品经柱前衍生高效液相色谱测定,得到图1、图2。

图1 20种氨基酸对照品HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of 20 amino acids reference substances注:1.天门冬氨酸(Asp)；2.谷氨酸(Glu)；3.丝氨酸(Ser)；4.组氨酸(His)；5.甘氨酸(Gly)；6.苏氨酸(Thr)；7.精氨酸(Arg)；8.丙氨酸(Ala)；9.酪氨酸(Tyr)；10.胱氨酸(Cys)；11.缬氨酸(Val)；12.蛋氨酸(Met)；13.苯丙氨酸(Phe)；14.异亮氨酸(Ile)；15.亮氨酸(Leu)；16.赖氨酸(Lys)；17.脯氨酸(Pro)；18.谷氨酰胺(Gln)；19.γ-氨基丁酸(GABA)；20. 色氨酸(Trp)。

图2 樟芝菌粉(S7)中游离氨基酸HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of free amino acids in sample(S7)

经LC 3D色谱数据工作站分析,以折线图表示不同批次樟芝菌粉、椴木栽培樟芝子实体和灵芝中游离氨基酸的种类和含量,得到图3。由图可见,10批次樟芝菌粉中游离氨基酸呈现非常相似的分布态势。

不同批次樟芝菌粉中,除S3含有19种氨基酸外(未检测到天冬氨酸),其余样品均含有20种氨基酸,樟芝菌粉中游离氨基酸总含量范围为96.12～132.87mg/g,RSD为11.20%,表明10批次菌粉间游离氨基酸总含量的差异较小;樟芝子实体(S11)中含有13种氨基酸,灵芝中(S12)为11种,两者氨基酸总含量分别为13.25、10.54mg/g,均远低于樟芝菌粉。不同批次樟芝菌粉中均以缬氨酸含量最高,色氨酸含量普遍最低;而樟芝子实体和灵芝则以脯氨酸的含量最高。

图3 样品中游离氨基酸的含量Fig.3 Content of free amino acids in samples

2.2 樟芝菌粉中结合氨基酸分析

按“1.2.5”项下方法计算样品中结合氨基酸含量。如表1及图4所示,樟芝菌粉中检测出18种结合氨基酸,其总含量范围为393.85～632.45mg/g,RSD为13.61%,表明10批次菌粉间结合氨基酸总含量的差异较小。樟芝子实体、灵芝中分别检测出17、16种结合氨基酸,其总含量远低于樟芝菌粉。不同批次菌粉均以谷氨酸含量最高;而樟芝子实体和灵芝则以脯氨酸含量最高。

不同批次樟芝菌粉必需氨基酸与总氨基酸比值(EAA/TAA)为24.06%(平均值),必需氨基酸与非必需氨基酸比值(EAA/NEAA)为31.81%,樟芝子实体EAA/TAA=23.03%,灵芝EAA/TAA=25.37%,均未达到WHO/FAO提出的理想蛋白质EAA/TAA=40%,EAA/NEAA=60%的标准。

图4 樟芝菌粉(S7)水解液中氨基酸HPLC图谱Fig.4 HPLC chromatogram of amino acids in hydrolyzate of sample(S7)

表1 样品中结合氨基酸组成和质量分数(mg/g)Table 1 Composition and concentration of combinative amino acids in samples(mg/g)

表2 各种必需氨基酸与WHO/FAO模式谱的比较Table 2 Comparision among human essential amino acide composition of samples and WHO/FAO recommeded pattern

2.3 营养评价

本文采用氨基酸比值系数法对樟芝菌粉中氨基酸进行营养评价,该方法根据氨基酸平衡理论设计而成。如果蛋白质中必需氨基酸齐全,且比例越接近或符合WHO/FAO的氨基酸模式要求,则其蛋白质的营养价值越高。将樟芝菌粉中各种必需氨基酸与模式谱进行比较,发现樟芝菌粉中除苯丙氨酸+酪氨酸外,其余几种必需氨基酸均低于WHO/FAO模式谱(表2)。樟芝子实体和灵芝中除亮氨酸外,其余氨基酸所占质量分数均低于模式谱。

根据表2进一步计算得出樟芝菌粉蛋白质的RAA、RC、SRC值,结果见表3。由RC值可知(表3),10批次菌粉中蛋氨酸+半胱氨酸普遍相对不足,为第一限制性氨基酸。赖氨酸为樟芝子实体中第一限制性氨基酸。蛋氨酸+半胱氨酸为灵芝中第一限制性氨基酸。樟芝菌粉、樟芝子实体、灵芝的SRC分别为51.831、42.081、24.387,说明樟芝菌粉中的蛋白质有更高的营养价值。

2.4 樟芝菌粉中游离氨基酸与结合氨基酸的比较

分别计算10批次樟芝菌粉中各游离氨基酸与结合氨基酸含量的平均值,结果见表4。

结果表明,樟芝菌粉中含有游离氨基酸20种,结合氨基酸18种,并都含有8种人体必需氨基酸。游离氨基酸中另含有谷氨酰胺(Gln)和γ-氨基丁酸(γ-GABA),Gln可通过抑制蛋白质降解系统各组分形成、前炎症因子和支链氨基酸的释放、诱导热休克蛋白的产生等方式来抑制蛋白质的降解[14];γ-GABA是一种非蛋白质组成的天然氨基酸,是哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质,具有降压、治疗癫痫、增强免疫力、镇痛、健脑等功效[15],已被卫生部批准为新资源食品,开发利用γ-GABA成为当前食品及医药领域的研究热点之一[16]。

表3 部分氨基酸的RAA、RC和SRC分析结果Table 3 The RAA，RC and SRC of amino acids

表4 樟芝菌粉中的氨基酸含量(mg/g)Table 4 Content of amino acids in Antrodia camphorata powder(mg/g)

本文测定的樟芝菌粉γ-GABA含量为1.57mg/g,高于臭灵丹草、龙眼[17-18]。樟芝菌丝体中,以游离态存在的氨基酸含量最高的为缬氨酸,结合态中含量最高的为谷氨酸;必需氨基酸中,游离态以缬氨酸含量最高,结合态以亮氨酸含量最高,这表明樟芝菌粉中氨基酸代谢的复杂性[19]。除天门冬氨酸、缬氨酸、蛋氨酸外,其余各氨基酸的结合态含量均高于游离态。RSD结果表明,游离氨基酸中胱氨酸、天门冬氨酸、蛋氨酸的含量在10批次菌粉间的差异较大,而结合氨基酸中以蛋氨酸、脯氨酸、天门冬氨酸的含量差异较大,其中蛋氨酸、脯氨酸在结合态中的含量差异明显大于游离态。

3 结论

10批次樟芝菌粉在氨基酸总量、必需氨基酸总量、EAA/TAA、EAA/NEAA值等方面差异较小,验证了樟芝菌粉发酵工艺的稳定性。樟芝菌粉中游离态氨基酸的种类多于结合态,但结合氨基酸总量和多数结合氨基酸的含量均高于游离态。樟芝菌粉中含有1种非蛋白氨基酸(γ-氨基丁酸),其含量为1.25～2.09mg/g,可作为γ-氨基丁酸的主要原材料用于新资源食品的开发。营养评价结果显示,樟芝菌粉氨基酸配比的合理性不高,有待进一步探讨。从氨基酸总量、必需氨基酸总量、EAA/TAA、EAA/NEAA、SRC值等指标综合判断,样品氨基酸品质高低顺序为樟芝菌粉>樟芝子实体>灵芝。本实验采用柱前衍生化HPLC法对不同批次、不同培植方法樟芝以及灵芝中氨基酸进行分析,并对其进行营养评价,为樟芝菌粉的开发利用、药材品质评价提供了参考依据。

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Analysis and nutritional evaluation ofamino acids inAntrodiaCamphoratapowder

CHEN Fei,ZHANG Feng-su,LIU Xun-hong*,YANG Nian-yun,HOU Ya,MA Yang

(Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)

To establish a method for determination of amino acids inAntrodiacamphoratapowder by HPLC with pre-column derivatization and for the evaluation of their nutritions. The samples were derived with o-phthalaldehyde(OPA). HPLC was performed on a Thermo Hypersil GOLD Dim column(150mm×4.6mm,3μm)with gradient elution of 20mmol/L sodium acetate-0.3% tetrahydrofuran-0.02% triethylamine(pH7.2)(A)and 100mmol/L sodium acetate-methanol-acetonitrile(200∶450∶350)(B)at the flow rate of 1mL/min,detected at 338.1nm. Besides,the method of ratio coefficient of amino acid was used for its evaluation of nutrition. The results showed that there were 20 free amino acids and 18 combinative amino acids inAntrodiacamphoratapowder,which indicated that the samples had abundant amino acids. In addition to Phe+Tyr,the contents of other essential amino acids were lower than that in WHO/FAO mode. Met+cys was the first limiting amino acid. The γ-aminobutyric acid was identified in the powders,and its average content was 1.57mg/g.

Antrodiacamphoratapowder;amino acids;pre-column derivatization HPLC;nutritional evaluation

2014-05-27

陈菲(1989-)，女，在读硕士研究生，主要从事中药品质评价研究。

*通讯作者:刘训红(1959-)，男，硕士，教授，主要从事中药资源化学与品质评价研究。

江苏高校优势学科建设工程资助项目(ysxk-2010)；南京中医药大学医史文献学科资助项目(WF2013-07)。

TS282.71

A

1002-0306(2015)05-0286-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.052