二子菊花饮抗氧化活性研究及其木犀草素和槲皮素含量测定

2015-03-24曹殿洁夏莲凤

食品工业科技 2015年5期

关键词：草素木犀槲皮素

戴一,曹殿洁,夏莲凤

(安徽新华学院药学院,安徽合肥 230088)

二子菊花饮抗氧化活性研究及其木犀草素和槲皮素含量测定

戴一,曹殿洁,夏莲凤

(安徽新华学院药学院,安徽合肥 230088)

二子菊花饮,高效液相色谱,木犀草素,槲皮素,抗氧化

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

女贞子购自于亳州药材市场,枸杞子、菊花为贡菊药圣堂制药有限公司;DPPH天津西玛科技有限公司,批号:132805;槲皮素对照品天津一方科技有限公司;木犀草素对照品天津一方科技有限公司;甲醇为色谱纯,乙醇、三氟乙酸、硝酸铝、亚硝酸钠、水杨酸、硫酸亚铁、双氧水、氢氧化钠、无水乙醇等试剂均为分析纯。

安捷伦1260高效液相色谱仪安捷伦1260 MWD检测器,安捷伦1260二元泵美国安捷伦科技公司;UV-4802S型紫外可见分光光度仪尤尼柯(上海)仪器有限公司;梅特勒-托利多AB135-S电子分析天平梅特勒-托利多国际股份有限公司;FA2004型电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司;Eppendorf Research 移液器德国Eppendorf 股份公司。

1.2 实验方法

1.2.1 二子菊花饮干膏的制备取女贞子、枸杞子各15g,菊花10g,加10倍量水,于圆底烧瓶中100℃回流提取1.5h,抽滤,煎煮3次,滤液合并、浓缩至干,真空40℃干燥48h,称重计算得膏率后备用[8]。

1.2.2 二子菊花饮抗氧化活性实验精密称取二子菊花饮水提取物配制成200、100、50、25、12.5、6.25mg/mL水溶液,采用DPPH法、水杨酸法和邻苯三酚自氧化法来进行抗氧化实验,采用origin8.0以样品的浓度与其对应的自由基清除率绘制曲线,拟合样品浓度与清除率之间关系的曲线方程,计算EC50[9-10]。

1.2.2.1DPPH·的清除实验精确称取5mgDPPH,用甲醇溶解并定容于100mL量瓶中,配制成0.05mg·mL-1的DPPH·溶液,于0～4℃避光保存,备用,将样品原液精确地配制成系列浓度的溶液。分别取样品溶液3.5mL(0.1mL样液+3.4mL水)与DPPH溶液2.5mL均匀混合,于黑暗中放置30min,在517nm处测定其吸光度值Ai,同时测定3.5mL水加2.5mLDPPH·溶液的吸光度A0,样品溶液3.5(0.1mL样液+3.4mL水)mL样品溶液加2.5mL甲醇的吸光度Aj,以2.5mL甲醇加3.5mL水做空白对照进行测定。根据DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100,计算DPPH·的清除率。

1.2.2.2 ·OH的清除实验在试管中加入不同浓度的样品溶液0.1mL,6mol/mL水杨酸-乙醇0.5mL,6mmol·L-1FeSO4溶液0.5mL,最后加入0.5mL0.1%H2O2,总体积5mL,以双蒸水补足体积。其中对照管不加样液,样底管不加H2O2,摇匀后启动反应,37℃水浴反应30min,以蒸馏水作参比,在510nm下测定各样品溶液的吸光度，计算·OH的清除率。

A样品为加入二子菊花饮水提物溶液后的羟自由基体系的吸光度值;A对照为不加二子菊花饮水提物溶液的羟自由基体系的吸光度值;A样底为羟自由基体系中不加H2O2而加二子菊花饮水提物溶液的吸光度值。

1.2.3 二子菊花饮中木犀草素和槲皮素的含量测定

1.2.3.1HPLC分析条件色谱柱:AgilentHC-C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-0.2%三氟乙酸(53∶47,V/V);流速1.0mL/min,检测波长350nm;柱温25℃[11];进样量20μL。

1.2.3.2 对照品溶液的制备精密称取木犀草素和槲皮素8.57mg和8.05mg置于100mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,并从中取1mL定容至10mL,制成木犀草素和槲皮素浓度分别为0.00857和0.00805mg/mL的混合对照品溶液。

1.2.3.3 供试品溶液的制备精密称取二子菊花饮水提取物0.5g,以甲醇定容至25mL容量瓶中,进样前用0.45μm微孔滤膜滤过。

1.2.3.4 线性关系考查精密吸取木犀草素和槲皮素混合对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL加甲醇定容至10mL,摇匀,吸取混合对照品溶液20μL进样分析,以浓度(C)对峰面积(A)绘制标准曲线。

1.2.3.5 精密度实验取同一质量浓度的木犀草素和槲皮素混合对照品溶液,重复进样6次,测定峰面积,计算峰面积的RSD。

1.2.3.6 重复性实验按二子菊花饮组方药材比例精密称取该方2g,共6份,按1.2.3.3项下方法制备供试品溶液后按1.2.3.1项下条件进行测定,计算木犀草素和槲皮素含量的RSD。

1.2.3.7 稳定性实验同一供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、10h后进样分析,计算木犀草素和槲皮素峰面积的RSD。

1.2.3.8 回收率实验精密称取9份已测定木犀草素和槲皮素含量的药材2.0g,按二子菊花饮所含两黄酮量的80%、100%和120%比分别加入对照品,每个加样比做3次实验,提取物浸膏减半称取制成供试品溶液后进行分析,计算木犀草素、槲皮素的平均回收率。

1.2.3.9 样品含量测定精密称取二子菊花饮提取物0.5g,各称取3份,按1.2.3.3项下方法制成供试品溶液,按1.2.3.1项下色谱条件下分析,测定峰面积,计算二子菊花饮中木犀草素及槲皮素含量。

2 结果与分析

2.1 二子菊花饮干膏的得率

通过平行3次实验对二子菊花饮方进行提取研究,得膏率平均为47.21%,具体结果见表1。

表1 二子菊花饮提取得膏率Table 1 Yield of the total extract from Erzi Juhua Yin

2.2 二子菊花饮抗氧化活性实验

2.2.1 DPPH·的清除实验通过对6个不同浓度的二子菊花饮提取溶液进行DPPH·的清除实验,发现二子菊花饮提取物在6.25～200mg/mL浓度范围内具有较好的清除率,经线性拟合,二子菊花饮提取物浓度(x)与清除率(y)的方程式为:y=0.2334x+38.992(r=0.9978),表明线性关系良好,EC50为47.16mg/mL。

图1 不同浓度二子菊花饮提取物对DPPH·清除作用Fig.1 Scavenging activity of different concentrations of Erzi Juhua Yin extraction on DPPH·

2.2.2 ·OH 的清除实验通过对6个不同浓度的二子菊花饮提取溶液进行·OH的清除实验,发现二子菊花饮提取物在6.25～200mg/mL范围内清除率逐步增加,尤其是在6.25～50mg/mL浓度范围内清除率增加显著，而100mg/mL及200mg/mL清除率增加缓慢,EC50为12.37mg/mL。

图2 不同浓度二子菊花饮提取物对·OH 清除作用Fig.2 Scavenging activity of different concentrations of Erzi Juhua Yin extraction on ·OH

图3 不同浓度二子菊花饮提取物对·清除作用Fig.3 Scavenging activity of different concentrations of Erzi Juhua Yin extraction on ·

2.3 二子菊花饮中木犀草素和槲皮素含量测定

2.3.1 标准曲线的绘制对5个不同浓度点的木犀草素和槲皮素混合对照品溶液进样分析后,以浓度(C)对峰面积(A)绘制标准曲线,得木犀草素和槲皮素回归方程分别为A=54119C+8.06,r=0.9992;A=42609C+2.14,r=0.9998,二者分别在0.171～0.857μg/mL和0.161～0.805μg/mL浓度范围呈良好的线性关系。

图4 木犀草素和槲皮素混合对照品HPLC色谱图 Fig.4 HPLC chromatograms of standard 注:1:槲皮素;2:木犀草素,图5同。

2.3.2 精密度实验、重现性、稳定性实验同一质量浓度的木犀草素和槲皮素混合对照品溶液进样6次分析后,木犀草素和槲皮素峰面积RSD分别为1.42%和1.29%,表明精密度良好,见表2。对6份制备的二子菊花饮供试液测定后,木犀草素和槲皮素含量的RSD 值分别为1.35%和1.41%,表明具有较好重现性,见表3。对于0、2、4、6、8、10h后进样分析的同一供试液,木犀草素和槲皮素峰面积的RSD分别为0.81%和0.77%,表明供试品溶液在10h 内稳定,见表4。

2.3.3 回收率实验 9份药材经加样制备供试液进行HPLC分析,其结果见表5、表6。木犀草素和槲皮素的回收率分别在95.75%～98.55%和95.22%～99.67%之间,RSD值均小于1.5%。

表2 精密度实验Table 2 Precision experiments

表3 重复性实验Table 3 Pepeatability experiments

表4 稳定性实验Table 4 Stability experiments

表5 木犀草素回收率实验Table 5 Method recevery of luteolin

2.3.4 二子菊花饮中木犀草素和槲皮素含量对3份二子菊花饮提取物进行HPLC分析,供试液色谱图为图5,结果见表7,表明二子菊花饮中含有较丰富的木犀草素和槲皮素。

表6 槲皮素回收率实验Table 6 Method recevery of quercetin

表7 二子菊花饮中木犀草素和槲皮素的含量Table 7 Contents of luteolin and quercetin in Erzi Juhua Yin

图5 二子菊花饮提取物HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of Erzi Juhua Yin extraction

3 结论

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Study on the antioxidant activities of Erzi Juhua Yinand the contents of luteolin and quercetin

DAI Yi,CAO Dian-jie,XIA Lian-feng

(School of Pharmaceutical Sciences of Anhui Xinhua University,Hefei 230088,China)