赵慧芳,吴文龙,马 丽,滕杰辉,姚 蓓,李维林

(江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京 210014)



基于抗氧化活性分析的蓝莓多酚提取工艺

赵慧芳,吴文龙,马 丽,滕杰辉,姚 蓓,李维林*

(江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京 210014)

基于对蓝莓不同极性溶剂(水、正丁醇、甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯)提取物以及甲醇提取、大孔树脂纯化后的乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物抗氧化活性(DPPH和ABTS)的分析测定,优化并确定了蓝莓多酚的提取工艺。实验结果显示,蓝莓不同溶剂提取物对DPPH、ABTS自由基具有良好的清除能力,其活性成分主要集中在大极性的70%乙醇、甲醇和正丁醇部位,经过大孔树脂纯化后萃取得到蓝莓不同极性多酚抗氧化活性强弱顺序为:正丁醇>水>乙酸乙酯。蓝莓提取物和萃取物的抗氧化能力与多酚含量有显著的相关性,与花色苷含量无关。较大极性的提取和萃取溶剂有利于蓝莓强效多酚的获取。以抗氧化活性为导向的蓝莓多酚提取工艺为:蓝莓果实以含0.3%三氟乙酸的70%乙醇提取,提取液经LS-305大孔树脂吸附,先用0.3%三氟乙酸水溶液冲洗去杂,再用含0.3%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱,洗脱液在40℃下减压浓缩除去甲醇后用水溶解,以乙酸乙酯萃取去杂,再以正丁醇萃取,萃取液在60℃下减压浓缩后冷冻干燥。

蓝莓,抗氧化,多酚,花色苷

蓝莓(Vacciniumspp.)为杜鹃花科越橘属植物[1],其果实中含有丰富的糖、有机酸、氨基酸、花色苷、鞣花酸、维生素E、天然视紫质、类黄酮等特殊物质[2],酸甜适口,并有清爽宜人的香气。近年来国内外临床实验表明,蓝莓多酚成分具有很强的抗氧化活性,能够促进视红素再合成,具有改善循环、抗溃疡、抗炎、提高机体免疫力、增强心脏功能、抗心血管疾病、延缓衰老、抗癌、抗突变[3-5]以及抑制细胞氧化损伤[6]、降低肝细胞脂肪积累[7]等功效。

近年来,关于蓝莓花色苷色素的提取方法已有研究报道,包括乙醇溶液浸提[8]和乙醇超声提取[9],对蓝莓多酚粗提物及其抗氧化活性的研究也有报道[10-11],刘翼翔等[6]进一步对蓝莓果实甲醇提取后XAD-7大孔树脂和Sephadex LH-20葡聚糖凝胶树脂纯化、结合乙酸乙酯萃取的方法得到的不同组分多酚进行了研究。鉴于多酚类物质包括花色苷色素的热不稳定性,在此类物质提取过程中,冻果破碎后直接提取的方法应用较为广泛,但也有人主张采用热烫工艺处理钝化多酚氧化酶后以防止果汁的褐变,但结果发现加热的同时也造成多酚物质的氧化及抗氧化活性的降低[12]。

超声提取利用超声波特有的空化现象以及空化中产生的极大压力促进细胞壁破裂及细胞内有效成分的快速溶出,可以极大地提高提取效率,缩短提取时间[9]。本文在采用超声波辅助提取的基础上,比较了不同极性溶剂提取以及提取物大孔树脂纯化后再用不同极性溶剂萃取所得蓝莓多酚的抗氧化活性,并以活性为导向确定了蓝莓多酚的提取工艺,以期为蓝莓多酚的开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓园蓝(Garden blue)品种鲜果于2012年购于江苏省溧水县蓝莓种植农户,清洗后-18℃速冻,在江苏泰州兴野食品厂加工成冻干果。DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) Sigma公司;ABTS(2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐) Sigma公司;没食子酸标准品 国药集团化学试剂有限公司;Folin-Ciocalteu’s 试剂 Sigma公司;其他试剂均为分析纯。

PL-5-B型低速离心机 上海安亭科学仪器厂;KQ-100DE数控超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司;Infinite M200型酶标仪 TECAN公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取方法 蓝莓粗提物:蓝莓冻干果粉25g,分别以含0.3%三氟乙酸的5种溶剂(水、正丁醇、甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯),料液比1∶5(g/mL),在30℃下超声辅助提取(功率180W)3次,每次30min,第2、3次料液比减半。合并提取液,4500r/min离心5min,取上清,40～60℃减压浓缩除去溶剂,浸膏冷冻干燥,得到样品水提物(WE)、正丁醇提取物(BE)、甲醇提取物(ME)、乙醇提取物(EE)、乙酸乙酯提取物(AE)。

蓝莓萃取物:蓝莓冻干果粉100g,以含0.3%三氟乙酸的甲醇为溶剂,遵循上述提取步骤得到浸膏样提取物,用500mL纯净水溶解、过滤,取300mL滤液上LS-305大孔树脂柱(柱直径2.5cm,流速约1.5BV/L),用0.3%三氟乙酸水溶液(约400mL)冲洗除去糖、酸等杂质,再用0.3%三氟乙酸甲醇溶液(约100mL)洗脱,收集洗脱液,40℃减压浓缩至浸膏状,用纯净水溶解并定容至150mL。取该样品溶液25mL,40℃减压浓缩至浸膏状,冷冻干燥后得到蓝莓总提取物(RP)。将其余125mL样液依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取3次,第1次用等体积,后2次用二分之一体积,合并萃取液,40℃减压浓缩除去溶剂,冷冻干燥后得到蓝莓乙酸乙酯萃取物(ARP);正丁醇萃取4次,第1次用等体积,后3次用二分之一体积,60℃减压浓缩除去溶剂,冷冻干燥后得到蓝莓正丁醇萃取物(BRP),剩余水部位50℃减压浓缩除去溶剂,冷冻干燥后得到蓝莓水萃取物(WRP)。

1.2.2 抗氧化活性的测定

1.2.2.1 ABTS抗氧化实验 ABTS工作液:称取13.4mg ABTS,加入3930μL水溶解保存;ABTS储存液:将5mL 7mmol/L ABTS和88μL 140mmol/L过硫酸钾混合,在室温避光条件下放置12～16h,形成ABTS储备液。ABTS工作液吸光度值为0.5±0.02。取上述各种提取物,以二甲基亚砜(DMSO)溶解,配制成20mg/mL的母液。先进行样品抗氧化活性的粗筛,在96孔板中,分别加入样品母液2.5μL,用无水乙醇补至每孔50μL,然后再加入200μL ABTS工作液,反应体系250μL,30℃条件下振荡1min,6min后测定其734nm下的吸光度(Ai);取50μL DMSO代替样品溶液测得空白吸光度(AC);以200μL无水乙醇代替ABTS混合液测得样品本底吸光度(Aj),计算样品的清除率,清除率高于50%再进行IC50的测定。测定IC50时每个样品设置4个以上的浓度,每个浓度重复3次,取平均值。以VC做对照,按公式(1)计算清除率,并计算出IC50值[13]。

式(1)

1.2.2.2 DPPH抗氧化实验 取上述各种提取物,以DMSO溶解,配制成20mg/L母液。DPPH用无水乙醇配制成0.16mmol/L,置于棕色瓶中备用。先进行样品抗氧化活性的粗筛,在96孔板中分别加入样品母液2μL,用无水乙醇补至100μL,再加100μL DPPH工作液,30℃下振荡1min,10min后测定其517nm下的吸光度(Ai);取100μL无水乙醇代替样品溶液测得空白吸光度(AC);以100μL无水乙醇代替DPPH工作液测得样品本底吸光度(Aj),按公式(1)计算清除率,清除率高于50%再进行IC50的测定。测定IC50时每个样品设置4个以上的浓度,每浓度重复3次,取平均值。

1.2.3 总花色苷和总多酚含量测定

1.2.3.1 总花色苷含量测定 花色苷在pH1.0下,510nm处有最大吸收,而当pH为4.5时,花色苷转变为无色查尔酮形式,在510nm处无吸收,据此可以用示差法计算溶液中的总花色苷含量[14]。取上述各种提取物,以DMSO溶解,配制成20mg/L母液。吸取2mL样品液,分别用pH1.0[0.2mol·L-1KCl∶0.2mol·L-1HC1=25∶67(V/V)]和pH4.5[0.2mol·L-1NaAc·3H2O∶0.2mol·L-1HAc=1∶1(V/V)]的缓冲液稀释至20mL,混匀,以2mL溶剂加18mL相应缓冲液作空白,分别在510nm和700nm处测定吸光值,并按下式计算稀释样品的吸光度(A):

A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

式(2)

然后按下式计算样品液中花色苷色素的浓度(以矢车菊色素-3-葡萄糖苷计)(C):

式(3)

果实总花色苷含量(ACY)按以下公式计算:

式(4)

其中:DF-稀释因子,V-提取液的总体积,mL;m-取样量,g;26900-矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数;449.2-矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔分子质量。

1.2.3.2 总多酚含量测定 标准曲线制作:准确称取500.0mg没食子酸,用纯净水溶解,定容至1000mL,分别移取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、9.0、10.5、12.5、14.5mL到50mL容量瓶中,加水定容,其中没食子酸的浓度分别为20、25、30、35、40、45、90、105、125、145mg·L-1。分别取不同浓度的标准溶液1.0mL,加入5.0mL 0.2mol·L-1Folin-Cioealteu’s试剂混合,在0.5～8min内加入4mL 7.5%(w/v)饱和碳酸钠溶液,充分混合。将上述混合标准溶液在25℃下避光放置2h后,在765nm波长下测定吸光值。以吸光度Y为纵坐标,没食子酸浓度X为横坐标,绘制标准曲线。

样品的测定:取上述各种提取物,以DMSO溶解,配制成20mg/L母液。样品液稀释适当的倍数(4～8)进行测定。吸取1.0mL待测液至10mL试管中,加入5.0mL 0.2mol·L-1的Folin-Ciocalteu’s试剂,充分混匀,在0.5～8min内加入4mL 7.5%(w/v)饱和碳酸钠溶液,25℃下放置2h后测定765nm下吸光度。根据回归方程计算总多酚含量(以没食子酸计)[15-16]。

1.3 数据处理

采用Excel2003分析软件进行数据的统计与分析,并用Excel2003分析软件绘制蓝莓提取物对自由基的清除曲线。

2 结果与分析

2.1 对ABTS的清除作用

蓝莓不同溶剂提取物和萃取物对ABTS自由基均有一定的清除能力(图1、图2)。不同溶剂提取物的ABTS自由基清除能力大小顺序为70%乙醇(EE)>甲醇(ME)>正丁醇(BE)>乙酸乙酯(AE)>水(WE),其中水提物(WE)在200～1200μg/mL的浓度范围内清除ABTS自由基能力随浓度的升高而升高,IC50为837.77μg/mL,清除能力较弱,其余溶剂提取物均在较低的浓度范围内即具有较高的清除能力,由此认为70%乙醇和甲醇是提取蓝莓抗氧化活性成分的最优溶剂。经过甲醇提取、大孔树脂纯化后的蓝莓总提取物(RP)清除ABTS自由基能力显著增强,IC50仅为纯化前甲醇提取物(ME)的17%。不同溶剂萃取物中正丁醇萃取物(BRP)清除ABTS自由基能力最强,IC50为1.41μg/mL,其次为水萃取物(WRP),乙酸乙酯萃取物(ARP)清除ABTS自由基能力稍弱,IC50为4.33μg/mL。

图1 蓝莓不同溶剂提取物对ABTS自由基的清除率Fig.1 ABTS free radical scavenging percentage of different solvent extracts from blueberry(Garden blue)

图2 蓝莓不同溶剂萃取物对ABTS自由基的清除率Fig.2 ABTS free radical scavenging percentage of liquid-liquid extracts after macroporous resin enrichment from blueberry(Garden blue)

2.2 对DPPH·的清除作用

蓝莓各种提取物对DPPH自由基清除能力较弱(图3),除甲醇提取物(ME)IC50为128.18μg/mL外,其余均未测得(表1)。经过甲醇提取、大孔树脂纯化后的蓝莓总提取物(RP)清除DPPH自由基能力显著增强,IC50仅为纯化前甲醇提取物(ME)的27%。不同溶剂萃取物中正丁醇萃取物(BRP)的清除DPPH自由基能力最强,IC50为18.28μg/mL,乙酸乙酯萃取物(ARP)清除能力最弱,剩余水部位(WRP)清除DPPH自由基的IC50为45.75μg/mL,介于两者之间(表1)。

图3 蓝莓不同提取物和萃取物对DPPH自由基的清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging percentage of different extracts from blueberry(Garden blue)

2.3 各提取物中的总花色苷和总多酚含量

标准曲线测定结果发现总多酚含量(以没食子酸计,Y)与吸光度(765nm,X)的回归方程为:y=0.01089x-0.23431,R2=0.9989,表明没食子酸浓度在20～145mg/L范围内线性关系良好,据此计算样品的总多酚含量。由表2可以看出,蓝莓不同溶剂粗提取物中总花色苷含量的高低顺序为70%乙醇>正丁醇>甲醇>乙酸乙酯>水,总多酚含量的高低顺序为甲醇>70%乙醇>乙酸乙酯>正丁醇>水。由此可见,选用70%的乙醇、甲醇作为蓝莓果实抗氧化活性物质的提取溶剂较好。根据所得提取物干重占原料干果粉重的百分比计算得率见表2，从提取物得率上来看甲醇>70%乙醇，但考虑到甲醇的毒性,生产中可用70%乙醇作提取溶剂，本文后续实验则选择了提取效率最高的甲醇作提取溶剂。

表1 蓝莓提取物和萃取物对DPPH·和 ABTS的半数清除浓度Table 1 The IC50 of different extracts from blueberry(Garden blue)to scavenge DPPH and ABTS radicals

表2 蓝莓不同提取物和萃取物总花色苷和总多酚含量Table 2 Total phenolics and total anthocyanins content of different extracts from blueberry(Garden blue)

经过甲醇提取大孔树脂纯化后的样品(RP)总花色苷含量达80.29mg/100g,较纯化前提高了4.3倍,总多酚含量达617.25mg/g,较纯化前提高了7.6倍。不同溶剂萃取物中,总花色苷含量高低顺序为正丁醇>水>乙酸乙酯,差异较大,总多酚含量的高低顺序为水>正丁醇>乙酸乙酯,差异较小。乙酸乙酯萃取物得率较低,其中的多酚含量较高,花色苷含量较低,可见乙酸乙酯部位主要为非花色苷类的多酚,跟文献比对,这部分可能为黄酮组分[7]。正丁醇是富集花色苷及多酚的良好溶剂,得率较高。综合分析上文ABTS和DPPH清除率数据可以发现,乙酸乙酯、正丁醇和水部位的清除自由基能力强弱为正丁醇>水>乙酸乙酯(表1),同总花色苷含量的高低顺序是一致的,因此可以考虑在以多酚为提取目标的工艺中先用乙酸乙酯萃取,除去非花色苷类杂质,然后用正丁醇作为溶剂富集蓝莓花色苷及多酚,以获得蓝莓抗氧化活性较高的成分。

2.4 相关性分析

分别考察了蓝莓提取物与抗氧化活性间的相关性及总多酚、总花色苷含量与抗氧化活性的相关性。结果发现,蓝莓提取物清除DPPH和ABTS自由基的IC50值成极显著相关(表3),即提取物对两种自由基的清除活性基本一致。

表3 蓝莓提取物ABTS和DPPH抗氧化活性间的相关系数Table 3 Correlation coefficient of antioxidant activities of blueberry extracts between ABTS and DPPH

注:**表示在0.01水平上显著相关。

由表4可见,蓝莓各提取物对DPPH自由基的清除能力与总多酚含量之间呈显著相关,即在一定范围内,总多酚含量越高,对DPPH自由基的清除能力越强;各提取物对DPPH自由基的清除能力与总花色苷含量无相关性;各提取物对ABTS自由基的清除能力与总多酚和总花色苷含量均没有相关性。

表4 蓝莓提取物抗氧化活性和总多酚、 总花色苷含量的相关系数Table 4 The correlation coefficient of the antioxidant activity and the content of total phenolics and total anthocyanins blueberry extracts

注:*表示在0.05水平上显著相关。

3 讨论与结论

蓝莓提取物对DPPH、ABTS自由基有良好的清除能力,其活性成分主要集中在70%乙醇、甲醇和正丁醇部位。经自由基清除能力与总多酚和总花色苷含量的相关性分析显示,蓝莓提取物的抗氧化活性与总多酚含量呈显著相关,与总花色苷含量没有相关性。蓝莓不同溶剂萃取物的抗氧化活性强弱顺序为正丁醇>水>乙酸乙酯,与苹果多酚抗氧化活性的研究结果不同[17]。

由于蓝莓果实的抗氧化活性与其中的多酚含量显著相关,所以可以以抗氧化活性为导向优化蓝莓多酚提取和纯化的工艺。本研究中蓝莓各种溶剂的粗提物中多酚含量较低,经大孔树脂富集后多酚含量大幅度提高。大孔树脂富集后各种溶剂的萃取物中,多酚含量略有下降,抗氧化活性表现不一,其中正丁醇萃取物对DPPH自由基清除的IC50最低,为18.28μg/mL,表明抗氧化能力最强。实验数据也显示,正丁醇萃取物得率较高,其中的多酚含量也较高。综合考虑提取成本和安全因素等,可以确定以抗氧化活性为导向的蓝莓多酚提取工艺为:蓝莓果实以含0.3%三氟乙酸的70%乙醇提取,提取液经LS-305大孔树脂吸附,先用0.3%三氟乙酸水溶液冲洗去杂后,再用含0.3%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱,洗脱液在40℃下减压浓缩除去溶剂后用水溶解,以乙酸乙酯萃取去杂,再以正丁醇萃取,萃取液在60℃下减压浓缩,冷冻干燥。

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Separation of polyphenols from blueberry basedon antioxidative activities

ZHAO Hui-fang,WU Wen-long,MA Li,TENG Jie-hui,YAO Bei,LI Wei-lin*

(Institute of Botany,Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210014,China)

Based on the determination of antioxidative activity,the extraction procedure of higher pure polyphenol from blueberry was optimized. The crude extracts were obtained by using different polar solvents(water,n-butyl alcohol,70% ethanol,methanol,ethyl acetate)from blueberry fruit. The ethyl acetate,n-butyl alcohol and water liquid-liquid extracts were orderly obtained from macroporous resin enrichment material after methanol extracted. The antioxidative activity of these extracts were measuredinvitroby the method of DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)and ABTS(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazolne-6-sulfonic)). The results showed that all these extracts had antioxidative activity,the active components of the crude extracts mainly existed in methanol,70% ethanol and n-butanol parts. The antioxidative activities of liquid-liquid extracts after macroporous resin enrichment order by polyphenols extracted with n-butanol>those extracted with water>those extracted with ethyl acetate. The activity of these extracts was significantly correlated with total polyphenol content,not with total anthocyanin content. This showed that blueberry polyphenols with strong free radical scavenging effects can be obtain with polar solvent. The optimal blueberry polyphenol extraction procedure based on antioxidative activity was confirmed as:blueberry was extracted with 70% ethanol containing 0.3% trifluoroacetic acid,then absorbed with LS-305 macroporous resin,firstly eluted with aqueous solution congtaining 0.3% trifluoroacetic acid to remove impurities,then eluted with methanol containing 0.3% trifluoroacetic acid,the eluent was concentrated at 40℃ under reduced pressure to remove solvents and then redissolved in water,extracted with ethyl acetate to remove impurities again,the rest was extracted with n-butanol,concertrated the n-butanol part at 60℃ under reduced pressure and freeze-drying.

blueberry;antioxidant activities;polyphenol;anthocyanin

2014-05-28

赵慧芳(1984- )，女，硕士，助理研究员，主要从事果品加工研究工作。

*通讯作者:李维林(1966-)，男，博士，研究员，研究方向:经济植物引种驯化、资源评价和开发利用。

江苏省产学研联合创新资金项目(BY2011198)；南京市科技发展计划(201301060)；江苏省农业三新工程项目(SXGC[2013]347)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)05-0251-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.044