周向军,杨金龙,路宛如

(天水师范学院生命科学与化学学院,甘肃天水 741001)



莴笋多酚氧化酶、过氧化物酶的特性及抑制作用研究

周向军,杨金龙,路宛如

(天水师范学院生命科学与化学学院,甘肃天水 741001)

采用分光光度法测定莴笋多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)的活性,研究酶的稳定性、温度、pH、底物浓度及几种抑制剂对其活性的影响,建立相应酶促动力学方程,利用正交实验探讨最佳抑制条件。结果表明,PPO和POD最适温度分别为50℃和40℃,最适pH分别为6.0和6.5,随温度不断升高,PPO和POD活性逐渐下降。动力学方程分别为V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])和V=3403.008[S]/(6.88×10-4+[S])。对PPO抑制强弱为:VC>L-Cys>NaHSO3>柠檬酸>EDTA>苯甲酸>琥珀酸,对POD抑制强弱为:EDTA>VC>L-Cys>柠檬酸>NaHSO3>琥珀酸>苯甲酸。正交实验表明,对PPO最佳抑制条件为:NaHSO39mmol/L、L-Cys 5mmol/L及VC5mmol/L。对POD最佳抑制条件为:VC0.2mmol/L、EDTA 0.2mmol/L及L-Cys 1.4mmol/L。

莴笋,多酚氧化酶,过氧化物酶,特性,抑制

莴笋(Asparagusplettuce)为菊科草本植物,在我国各地普遍栽培。莴笋适合鲜切或速冻等加工,但在加工过程中极易发生褐变。多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)和过氧化物酶(peroxidase,POD)是引起果蔬褐变的关键酶,当氧气存在时,前者能催化内源酚氧化生成醌,醌与氨基酸(或蛋白质)作用生成高分子络合物,从而导致褐色素的生成,色素分子量愈高,颜色愈暗[1-2],后者是H2O2在POD作用下,生成强氧化性的新生态氧,将酚类化合物氧化,生成各种自由基,随后通过分子间聚合生成聚合物[3]。果蔬褐变将影响其感官品质、市场和营养价值[4-5]。控制酶促褐变的方法较多,物理法如漂烫,易导致果蔬质地变软[6],热处理易影响果汁风味,有一定局限性,因而目前化学法使用较多。王国英[7]研究西葫芦PPO的特性,并比较了几种抑制剂的抑制强弱。范腾[8]研究胡萝卜的POD和苯丙氨酸解氨酶的特性和抑制条件。李晓莉[9]研究几种抑制剂对山药PPO的抑制强弱为:L-抗坏血酸>柠檬酸>苹果酸。孔维宝[10]研究表明,L-cys并不是通过对PPO活性中心的结构性修饰,或是发生共价结合来抑制其活性,而是直接与其酶促反应产物醌类物质结合生成无色的硫氢化合物,从而抑制褐变的发生。本实验研究莴笋 PPO和POD特性,探讨了几种抑制剂对其活性的影响,为深入明确莴笋褐变的机理、控制褐变提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜莴笋除去叶和纤维化不可食用部分,低温储存;VCsigma产品;L-Cys 国药集团化学试剂有限公司;NaHSO3天津市凯信化学工业有限公司;柠檬酸,EDTA 天津德县化学试剂有限公司;苯甲酸 中国新中化学厂;琥珀酸 化学试剂厂,均为分析纯;反应混合液:100mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液50mL,愈创木酚28μL,磁力搅拌溶解,加入30%H2O219μL,混匀备用。

722型可见分光光度计 上海欣茂有限公司;PHS-3D雷磁pH计 上海精密科学有限公司;TGL-20M型高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;AL204型电子天平 梅特勒-托利多。

1.2 实验方法

1.2.1 酶液的制备及活性测定 称5.0g新鲜莴笋,置于研钵中,加少许石英沙,5.0mL磷酸缓冲液,冰浴研磨成匀浆,4℃,12000r/min离心15min,收集上清液,定至25mL[11]。PPO活性测定:试管中加入50mmol/L pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液4.0mL和50mmol/L邻苯二酚溶液1.0mL,最后加入100μL酶液,立即开始计时,420nm测吸光值。POD活性测定:试管中加入3mL,25mmol/L反应混合液和0.1mL酶液,0.2mL 0.5mol/L H2O2,迅速混合,470nm测定。以吸光值变化表示酶活。定义:吸光值每分钟变化0.01所需的酶量定义为一个活力单位(U)。

1.2.2 反应进程曲线 在0～15min范围内,每隔1min,测定PPO吸光值。在0～8min范围内,每隔30s,测定POD吸光值。以时间为横坐标,吸光值为纵坐标,制作反应进程曲线,确定PPO和POD测定时间。

1.2.3 温度对酶活性的影响和稳定性实验 pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液3.0mL在35、40、45、50、55、60、65℃下保温10min,加入50mmol/L邻苯二酚1.0mL,0.1mL酶液,混匀,测定OD420。酶在50、60、70、80、90℃下分别预热一定时间,探讨PPO稳定性。反应混合液3.0mL,在35、40、45、50、55、60℃下保温10min,加入0.5mL酶液,测定OD470。酶在40、50、60、70、80、90℃下分别预热一定时间,探讨POD稳定性。

1.2.4 pH对酶活性的影响 pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0乙酸-乙酸钠缓冲液3.0mL,保温10min,加入1mL邻苯二酚溶液和0.1mL酶液,测定OD420,确定PPO最适pH。pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的反应混合液3.0mL,保温5min,加入0.5mL酶液,摇匀,测定OD470,确定POD最适pH。

1.2.5 不同底物浓度对酶活性的影响 50℃、pH6.0条件下,测定邻苯二酚分别为0.001、0.002、0.004、0.005、0.008、0.01mol/L时吸光值,制作底物浓度随时间的变化曲线,并拟合各直线斜率,计算PPO的Vmax和Km[12]。40℃、pH6.5条件下,测定愈创木酚分别为0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012mol/L时吸光值,制作底物浓度随时间的变化曲线,并拟合各直线,计算POD的Vmax和Km。

1.2.6 不同抑制剂对酶活性的影响 以乙酸-乙酸钠缓冲液为对照,加入终浓度分别为0、2、4、6、8、10mmol/L的L-Cys、VC、NaHSO3,0、20、40、60、80、100mmol/L的EDTA、柠檬酸、苯甲酸和琥珀酸,测定PPO吸光值,计算相对剩余酶活。0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mmol/L的EDTA、VC,0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mmol/L的L-Cys,0、4、6、8、10、12mmol/L的NaHSO3,0、40、60、80、100、120mmol/L的柠檬酸、苯甲酸和琥珀酸,测定POD吸光值,计算相对剩余酶活。

相对剩余酶活(%)=测定管酶活性×100/对照管酶活性

1.2.7 正交实验 根据单因素实验结果,选择抑制作用较强的几种抑制剂进行正交设计,见表1和2。

表1 PPO正交实验设计Table 1 Orthogonal experiment of PPO

表2 POD正交实验设计Table 2 Orthogonal experiment of POD

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 酶促反应进程曲线的确定

由图1a可知,2min内PPO的反应速率随时间变化成线性增长,随后反应速率逐渐降低并趋于平缓。由图1b可知,3min内POD的反应速率随时间的变化呈线性增加,随后曲线趋于平坦,反应速率下降。反应速率随时间延长降低的原因是底物浓度逐渐下降;产物增加加速了逆反应的进行;随时间延长酶本身部分失活等,因此,酶活测定应选择反应初速率,避免上述因素的干扰[13],本实验PPO和POD测定时间分别2min和3min。

图1 酶促反应进程曲线Fig.1 Standard curve of enzyme catalysis

注：a：PPO反应进程曲线；b：POD反应进程曲线。

图2 温度对酶活性及稳定性的影响Fig.2 Effect of temperature on enzyme and stabilities注：a,c分别表示温度对PPO和POD活性的影响； b,d分别表示PPO和POD对温度的稳定性。

2.2 PPO和POD的最适温度及稳定性

PPO吸光值随温度的变化见图2a,在30～50℃范围内,随温度升高,吸光值逐渐增大,50℃时达到最大值,随后迅速下降,故最适温度为50℃,这是因为随温度增加,底物分子动能增大,反应速率增加,当温度高于50℃时,随着温度增加,蛋白质分子的热运动增大,导致蛋白变性[14]。由图2b可知,随温度升高,酶活力逐渐下降,90℃时几乎没有活性。由图2c可知,POD最适温度为40℃,40℃以下时,POD活性随温度的升高而逐渐增加,褐变程度加深,当温度大于50℃时,酶活性迅速下降。由图2d可知,随温度不断升高,POD活性逐渐下降,80℃时几乎没有活性。

2.3 pH对莴笋PPO和POD活性的影响

由图3a可知,随pH升高,PPO速率上升,pH6.0时达最大值,故最适pH为6.0,继续增大pH,PPO活性迅速下降,这可能与多酚氧化酶的活性部位含有组氨酸基团(pK=6.0)有关[15]。由图3b可知,pH5.5时出现一个肩峰,这可能是由于反应液中存在同工酶的缘故。过酸或过碱均不利于POD活性。pH大于6.5时,酶活性开始降低,故POD最适pH为6.5。

图3 pH对酶活性的影响Fig.3 Effect of pH on enzyme注：a,b分别表示pH对PPO和POD活性的影响。

2.4 不同底物浓度对莴笋PPO和POD活性的影响

底物浓度对PPO的影响及其双倒数作图见图4a和图4b,PPO的Km=0.0059mol/L,Vmax=342.566U/min·g,V=342.566[S]/(0.0059+[S])。底物浓度对POD的影响及其双倒数作图见图4(c)和(d),求得POD的Km=6.817×10-4mol/L,Vmax=3403.008U/min·g,V=3403.008[S]/(6.817×10-4+[S])。

图4 底物浓度对酶活性的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on enzyme注：a,b分别表示PPO的v-t曲线和1/V-1/S曲线; c,d分别表示POD的v-t曲线和1/V-1/S曲线。

2.5 不同抑制剂对莴笋PPO和POD活性的影响

各抑制剂对莴笋PPO及POD活性的影响见图5a～图5d,IC50计算结果见表3。L-Cys可与反应所产生的醌结合,形成一种稳定的无色化合物,同时其结构中的-COOH螯合金属离子作用很强,可作用于PPO中的Cu2+[16]。VC可作为酶分子中Cu2+的螯合剂,抑制酶促褐变的发生,另外VC既可作为醌的还原剂,将体系中原有的醌类还原为无色物质,甚至其可被PPO直接氧化,起到竞争性抑制剂的作用[17-18]。NaHSO3与醌不可逆的生成无色产物,与此同时降低了酶作用于一元酚和二羟基酚的活力,同时NaHSO3具有漂白和抑制微生物作用[19]。柠檬酸对PPO的抑制机制是由于柠檬酸分子中的-COOH对PPO中的Cu2+有较强的螯合作用[20]。苯甲酸和琥珀酸主要是提供酸性环境,使PPO偏离最适pH。EDTA提供碱性环境,并具有螯合金属离子的作用[21]。

图5 不同抑制剂对PPO和POD的影响Fig.5 Effect of different inhibitors on PPO and POD注：a：L-Cys、VC及NaHSO3对PPO活性的影响; b：柠檬酸、琥珀酸、苯甲酸及EDTA对PPO活性的影响; c：EDTA、VC及L-Cys对POD活性的影响; d：NaHSO3、柠檬酸、苯甲酸及琥珀酸对POD活性的影响。

抑制剂对PPO的IC50(mmol/L)对POD的IC50(mmol/L)VC17740100L-Cys34280700NaHSO350199712柠檬酸217766218EDTA251960064苯甲酸3080248562琥珀酸5407032210

2.6 正交实验

由表4可知,对PPO抑制的最佳组合为A2B1C1,即NaHSO39mmol/L,L-Cys 5mmol/L,VC5mmol/L,由表5可知,A(NaHSO3)和C(VC)对PPO的抑制达到极显著(p<0.05),B(L-Cys)的影响不显著(p>0.05)。最佳条件下重复3次,对PPO抑制率为(35.96±0.88)%。由表6可知,对POD抑制的最佳组合为A1B2C3,即VC0.2mmol/L,EDTA 0.2mmol/L,L-Cys 1.4mmol/L,由表7可知,A(VC)对POD的抑制达到极显著(p<0.05),B(EDTA)和C(L-Cys)的影响不显著(p>0.05)。最佳条件下重复3次,对POD抑制率为(34.97±0.31)%。

表4 对PPO抑制的正交结果Table 4 Results of orthogonal experiment for PPO

表5 PPO方差分析Table 5 Analysis of variance for PPO

表6 对POD抑制的正交结果Table 6 Results of orthogonal experiment for POD

表7 POD方差分析Table 7 Analysis of variance for POD

3 结论

莴笋PPO和POD最适温度分别为50℃和40℃,最适pH为6.0和6.5。随温度不断升高,PPO和POD活性逐渐下降。莴笋PPO的Km=5.9×10-3mol/L,Vmax=342.566U/min·g,V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])。POD的Km=6.817×10-4mol/L,Vmax=3403.008U/min·g,V=3403.008[S]/(6.817×10-4+[S])。对PPO抑制强弱为:VC>L-Cys>NaHSO3>柠檬酸>EDTA>苯甲酸>琥珀酸。对POD抑制强弱为:EDTA>VC>L-Cys>柠檬酸>NaHSO3>琥珀酸>苯甲酸。

[1]刘军伟,胡志和,苏莹. 紫薯中多酚氧化酶活性的研究及褐变控制[J]. 食品科学,2012,33(17):207-211.

[2]李超,郑义,王乃馨,等. 牛蒡多酚氧化酶的特性及酶促褐变的抑制[J]. 食品工业科技,2011,32(6):121-124.

[3]Serrano-Martinez A,Fortea M I,del Amor F M,et al. Kinetic characterization and thermal inactivation study of partially purified red pepper(Capsicum annuum L.)peroxidase[J]. Food Chemistry,2008,107(1):193-199.

[4]柳素洁,杜金华,单玲克,等. 香蕉中多酚氧化酶性质及褐变控制[J]. 食品与发酵工业,2012,38(2):126-130.

[5]Saxena A,Bawa A S,Raju P S. Effects of minimal processing on quality of jackfruit(Artocarpus heterophyllus L.)bulbs using response surface methodology[J]. Food and Bioprocess Technology,2012,5(1):348-358.

[6]Soliva-Fortuny R C,Elez-Martinez P,Sebastian-Caldero M,et al. Kinetics of polyphenol oxidase activity inhibition and browning of avocado puree preserved by combined methods[J]. Journal of Food Engineering,2002,55(2):131-137.

[7]王国英,董海洲,王兆升,等. 西葫芦多酚氧化酶美学特性研究[J]. 食品工业科技,2012,33(2):154-159.

[8]范腾,董海洲,王兆升. 胡萝卜中过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶特性及抑制条件的研究[J]. 中国食品学报,2011,11(7):22-28.

[9]李晓莉,沈金玉,黄家音. 山药多酚氧化酶特性研究[J]. 精细化工,2005,22(7):527-529.

[10]孔维宝,陆健,赵海锋,等. L-半胱氨酸抑制多酚氧化酶的机制研究[J]. 食品科学,2007,28(11):66-70.

[11]张志良,瞿伟堇. 植物生理学实验指导第三版[M]. 北京:高等教育出版社,2005:378-379.

[12]易建华,李美利,朱振宝. 苹果多酚对多酚氧化酶氧化特性的影响[J]. 现代食品科技,2013,29(11):2601-2606.

[13]王镜岩,朱圣庚,徐长法. 生物化学第三版上册[M]. 北京:高等教育出版社,2002:335-336.

[14]黎婕,陈中,林伟锋. 梅州金柚果肉中过氧化物酶特性的研究[J]. 食品工业科技,2014,35(1):133-136.

[15]沈金玉,黄家音,李晓莉. 芦荟多酚氧化酶特性的研究[J]. 食品与发酵工业,2005,31(3):21-25.

[16]Wang Si-yuan,Lin Tian-tian,Man Guo-wei,et al. Effects of anti-browning combinations of ascorbic acid,citric acid,nitrogen and carbon dioxide on the quality of banana smoothies[J]. Food and Bioprocess Technology,2014,7(1):161-173.

[17]刘军伟,胡志和,苏莹. 紫薯中多酚氧化酶活性的研究及褐变控制[J]. 食品科学,2012,33(17):207-211.

[18]华颖,沈国华,刘大群. 白萝卜多酚氧化酶的酶学特性研究[J]. 现代食品科技,2014,30(1):69-73.

[19]郑天闻,徐婷婷,范亚苇,等. 莲子多酚氧化酶的酶学性质[J]. 食品工业科技,2014,35(2):162-165.

[20]汤凤霞,魏好程,曹禹. 芒果多酚氧化酶的特性及抑制研究[J]. 食品科学,2006,27(12):156-158.

[21]张莉,陈乃富. 苔干多酚氧化酶的酶学特性研究[J]. 食品工业科技,2011,32(12):200-202.

Properties and inhibitions of polyphenoloxidase andperoxidase fromAsparagusplettuce

ZHOU Xiang-jun,YANG Jin-long,LU Wan-ru

(College of life science and chemistry,Tianshui Normal University,Tianshui 741001,China)

The activities of polyphenoloxidase(PPO)and peroxidase(POD)fromAsparagusplettucewere determined by spectrophotometer. Enzyme stabilities,the effects of temperature,pH,substrate concentration and several inhibitors on PPO and POD,and their corresponding reaction kinetics equation were studied. Orthogonal experiments were used to optimize inhibition technology. The results showed that the optimum temperature and pH of PPO and POD were 50℃ and 40℃,pH6.0 and pH6.5,respectively. Activities of PPO and POD decreased with increasing temperature. Kinetic equation for PPO and POD were V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])and V=3403.008[S]/(6.88×10-4+[S]),respectively. Inhibition effects were as follows:VC>L-Cys>NaHSO3>citric acid>EDTA>benzoicacid>succinic acid for PPO,EDTA>VC>L-Cys>citric acid>NaHSO3>succinic acid>benzoic acid for POD. Orthogonal experiments showed that the optimum inhibition conditions were as follows:NaHSO39mmol/L,L-Cys 5mmol/L and VC5mmol/L for PPO,VC0.2mmol/L,EDTA 0.2mmol/L and L-Cys 1.4mmol/L for POD,respectively.

Asparagusplettuce;polyphenoloxidase;peroxidase;properties;inhibition

2014-07-08

周向军(1980-)，男，硕士研究生，讲师，研究方向：食品酶学。

TS255.3

A

1002-0306(2015)05-0166-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.026