孔 琪,玉秋萍,王家胜,何磊磊,张 妮,余正文

(贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳 550001)



不同二氢杨梅素含量的显齿蛇葡萄提取物的抗菌活性与清除DPPH自由基能力研究

孔 琪,玉秋萍,王家胜,何磊磊,张 妮,余正文*

(贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳 550001)

研究不同二氢杨梅素含量的显齿蛇葡萄提取物的抗菌活性与清除DPPH自由基能力。选取17种二氢杨梅素含量不同的显齿蛇葡萄,使用乙醇超声辅助法获得各个样品的提取物;采用药敏滤纸片法和二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)体系分别研究提取物以及相同含量的二氢杨梅素纯品的抗菌活性和清除DPPH自由基能力。结果表明:17种提取物的抗菌活性和清除DPPH自由基能力随着提取物中二氢杨梅素含量的增加而增强,提取物的抗菌活性和清除DPPH自由基能力显著强于相应含量二氢杨梅素纯品。在10mg/mL浓度下,部分提取物的抑菌活性强于二氢杨梅素;对DPPH·清除作用:二氢杨梅素大于全部样品;样品10～17大于VC;样品2～17大于BHT。

显齿蛇葡萄提取物,二氢杨梅素,抗菌活性,清除DPPH·

显齿蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)是葡萄科蛇葡萄属的一种多年生藤本植物,俗称“藤茶”“霉干茶”“白毛猴”等,主要分布于江西、湖南、广东、广西、重庆、贵州、湖北等省区[1]。显齿蛇葡萄叶中的主要活性成分为黄酮类化合物[2],还含少量蛋白质、氨基酸、多糖、挥发性成分、鞣质、萜类、蒽醌类、有机酸及甾体和其他物质。黄酮类化合物其主要包括二氢杨梅素(Dihydromyricetin)、杨梅素(Myricetin)、槲皮素(Quercetin)等[2],其中二氢杨梅素含量高达39.50%[3]。此类物质具有抗菌、抗氧化、消炎、抗肿瘤等多种功效[4-13]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料 实验所用植物材料[3](如表1所示)于2013年5月份采自全国不同地区,均为单株显齿蛇葡萄的叶子,叶子经60℃烘干,粉碎,过40目(0.42mm)筛。

1.1.2 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus) 由上海顺勃生物工程技术有限公司购得;大肠埃希菌(Escherichiacoli)、绿脓杆菌(p.aeruginosa)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 贵州师范大学微生物实验室提供。培养基:细菌培养基,具体制备参考文献[14]。

1.1.3 药品与试剂 二氢杨梅素 本实验室自制,含量≥98%;DPPH·样品 Sigma公司;抗坏血酸(VC)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、二甲基亚砜(DMSO)、70%乙醇 均为分析纯。

1.1.4 仪器 DH6000恒温培养箱 天津泰斯特仪器有限公司;ASV-3023高压灭菌器 北京医讯成科技有限公司;SW-CJ-ZF型双人双面净化工作台 苏州江东精密仪器有限公司;TS-2102C恒温摇床 常州诺基仪器有限公司;BCD-221CHFA电冰箱 合肥美菱股份有限公司;752E型紫外可见分光光度计 天津普瑞斯仪器有限公司;EYELA旋转蒸发仪N-1001V 上海爱朗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 待测液制备 准确的称取17种显齿蛇葡萄粉末各200mg,用15mL体积分数为70%的乙醇浸泡1h之后进行超声提取。100kHz超声辅助法超声60min,得到滤液。重复提取3次,将所得滤液用旋转蒸发仪蒸干,得到提取物粗品,准确称量(如表1所示),用二甲基亚砜配制成10.0mg/mL的待测液,根据用样量和已知显齿蛇葡萄中的二氢杨梅素含量及提取物粗品重量,计算出所配待测液的二氢杨梅素浓度(如表1所示)。二氢杨梅素纯品(含量≥98%)用二甲基亚砜配制成浓度梯度为1.0～10.0mg/mL的溶液作为对照品。

1.2.2 抑菌实验

1.2.2.1 含菌平皿制备 参考文献[15]将菌种活化到制备好的试管斜面上在37℃恒温培养箱培养24h。将在琼脂培养基斜面上活化的细菌分别挑取一个环于装有50mL的液体营养琼脂培养基的三角瓶内,在恒温37℃的摇床上180r/min振荡培养18h。采用稀释平板菌落计数法对摇好的细菌进行计数,把上述菌液分别用灭菌生理盐水配制成106～107cfu/mL的菌悬液。取上述配制好的菌悬液0.2mL接种于培养皿内,用灭菌的涂布棒均匀涂布。

1.2.2.2 抑菌圈的测定 采用滤纸片扩散法[14]。将滤纸用打孔器打成直径为7mm的圆纸片,121℃干热灭菌20min后,将小圆片贴于含菌平皿上,每个平皿三片,为三次重复。取1.2.1所配制的10.0mg/mL待测液25μL加于滤纸片上。以浓度梯度为1.0～10.0mg/mL的二氢杨梅素纯品溶液为对照。以只加二甲基亚砜溶液的平皿为空白对照。将细菌平皿置于37℃恒温箱培养24h。取出观察,采用十字交叉法测量抑菌圈大小,重复3次取平均值。

1.2.3 DPPH自由基清除实验

1.2.3.1 DPPH·清除剂制备 将待测液用70%乙醇按照10倍稀释法稀释到1000倍(即将10mg/mL稀释为10μg/mL)待用。二氢杨梅素纯品用70%乙醇配制成浓度梯度1.0～10.0mg/mL溶液,用10倍稀释法稀释到1000倍待用。VC和BHT配制方法同二氢杨梅素,作为对照。

1.2.3.2 DPPH·清除率测定方法 参考文献[13]并改进。在5mL离心管中依次加入0.08mg/mL的DPPH·溶液(准确称取20mg DPPH,加70%乙醇溶解于小烧杯中,移至250mL容量瓶,定容)和70%乙醇各2mL,混匀反应稳定(约30min)后,以70%乙醇为对照,使用紫外可见分光光度计在λ=517nm处测吸光度,记为A1。将上述的DPPH·溶液换为稀释的待测液,测得吸光度,记为A2。将上述70%乙醇换为稀释的待测液,测得吸光度,记为A3。二氢杨梅素、VC和BHT测量如上取代待测样液即可。计算自由基清除率(Y),公式为:

Y(%)=[1-(A3-A2)/A1]×100

2 结果与分析

2.1 抑菌实验结果

药敏滤纸片法测定抑菌圈结果显示不同二氢杨梅含量提取物对五种细菌均具有抑菌作用,并随着二氢杨梅含量的增加抑菌能力增强(如表2所示);二氢杨梅素对照品对五种细菌的抑菌作用随二氢杨梅浓度增加而增强(如表3所示)。将表2和表3对比,用表2中的二氢杨梅素浓度小于1.0mg/mL的待测液抑菌圈与表3中的1.0mg/mL的二氢杨梅素抑菌圈比较,用表2中二氢杨梅素浓度小于2.0mg/mL的待测液抑菌圈与表3中的2.0mg/mL二氢杨梅素抑菌圈比较,以此类推。可以得出不同二氢杨梅含量的提取物抑菌能力远远大于其所含二氢杨梅素的抑菌活性。且当二氢杨梅素的浓度与待测液浓度相等为10.0mg/mL时,比较两者抑菌活性,样品8～17对金黄色葡萄球菌的抑菌作用强于二氢杨梅素;样品9～17对表皮葡萄球菌的抗菌活性强于二氢杨梅素;样品9、11～17种对大肠杆菌的抑菌活性强于二氢杨梅素;样品11～17对绿脓杆菌的抑菌活性大于二氢杨梅素;样品9～17对枯草芽孢杆菌的抗菌活性强于二氢杨梅素。

表1 实验所用样品Table 1 Samples used in the experiments

表2 不同二氢杨梅素含量的提取物(10.0mg/mL)体外抑菌作用(抑菌圈直径,mm)Table 2 In vitro inhibitory effect of extracts(10.0mg/mL)with different content of dihydromyricetin(inhibition zone diameter,mm)

注:*提取物配成10.0mg/mL待测液中二氢杨梅素浓度。

表3 二氢杨梅素的体外抑菌作用(抑菌圈直径,mm)Table 3 In vitro inhibitory effect ofdihydromyricetin(Inhibition zone diameter,mm)

2.2 DPPH自由基清除实验结果

不同二氢杨梅含量的提取物对DPPH自由基都具有清除作用,且清除作用随着所含二氢杨梅素量的增加而增强。二氢杨梅素、VC和BHT对DPPH自由基的清除作用随着浓度的增加而增加(如表4所示)。用表4待测液中二氢杨梅素浓度小于2.0μg/mL样品的清除率与2.0μg/mL二氢杨梅素纯品的清除率比较,用待测液中二氢杨梅素浓度小于4.0μg/mL样品的清除率与4.0μg/mL二氢杨梅素纯品的清除率与比较,以此类推。可以得出不同二氢杨梅含量的提取物对DPPH自由基清除能力远远大于其所含二氢杨梅素的清除能力。且当二氢杨梅素、VC、BHT的浓度与待测液浓度相等为10.0μg/mL时,比较对DPPH·清除作用:二氢杨梅素大于全部样品;样品9～17大于VC;样品2～17大于BHT。

3 结论与讨论

3.1 本文选用17种不同二氢杨梅素含量的显齿蛇葡萄样品,其中二氢杨梅素2.33%～38.20%相差很大。其原因可能是显齿蛇葡萄分布地区较广,不同产地显齿蛇葡萄所含物质种类和含量都具有一定的差异,这与品种、地区气候、生长时间、取样部位等有一定的关系[3]。二氢杨梅素含量较低的样品,提取物除二氢杨梅素外可能还有其他黄酮类、苷类、酚酸类、萜类等化合物[2],本实验结果显示不管提取物是与所含二氢杨梅素还是与等浓度二氢杨梅素纯品做抗菌和清除DPPH自由基能力比较,其结果都存在一定的差异,之所以结果有差异就是提取物中的这些化合物与二氢杨梅素的综合作用。但不可否认二氢杨梅素是显齿蛇葡萄提取物中的主要活性物质。提取物的抗菌活性和清除DPPH自由基能力与其所含的二氢杨梅素含量是有相关性的,随着二氢杨梅素含量的增加而增加。有些提取物中二氢杨梅素含量高的样品抗菌活性甚至超过等浓度的二氢杨梅素,对DPPH自由基能力也强于等浓度的VC和BHT。

表4 不同二氢杨梅含量显齿蛇葡萄提取物与二氢杨梅素、VC、BHT对DPPH 自由基的清除作用Table 4 The scavenging efect of extracts from Ampelopsis grossedentata with different contentof dihydromyricetin,different content of VC and BHT on DPPH·

注:*稀释1000倍后待测液中二氢杨梅素浓度。

3.2 近年来二氢杨梅素作为天然抗菌抗氧化剂被广泛应用于食品、药品、保健品中,但二氢杨梅素属于天然的黄酮类化合物,存在脂溶性和水溶性较差、生物利用率低、稳定性不好等缺点,而粗提物往往具有较高的溶解性,且可能具有更好的生物利用度。本实验证明显齿蛇葡萄提取物也具有较好的抗菌和清除DPPH自由基活性,在以后的生产应用中可以考虑直接使用提取物。

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Study on the antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability ofextracts fromAmpelopsisgrossedentatawithdifferent content of dihydromyricetin

KONG Qi,YU Qiu-ping,WANG Jia-sheng,HE Lei-lei,ZHANG Ni,YU Zheng-wen*

(School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)

The antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability of extracts of seventeenAmpelopsisgrossedentatasamples with different content of dihydromyricetin(DMY)were studied. The extracts were prepared from leaves ofA.grossedentataunder ultrasonic wave-assisted ethanol extraction,the inhibition zone method was used to study the antibacterial activity of extracts,and the DPPH· radical scavenging effect of extracts was investigated using UV spectrophotometer method. In the meantime,antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability of the contented DMY in extracts and the same concentration of standard DMY were determined to make comparisons. Results showed that all of these extracts had antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability,and the activities were enhanced with the increasing of DMY content in the extracts. The antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability of extracts were significantly stronger than the same concentration of DMY. Under the concentration of 10mg/mL,some of the extracts expressed greater antibacterial activity than the same concentration of DMY,and for DPPH· scavenging capability,DMY has stronger than all extracts,extracts(No. 10～17)have better than VCand extracts(No. 2～17)have better than BHT.

extracts fromAmpelopsisgrossedentata;dihydromyricetin;antimicrobial activitiy;DPPH·

2014-05-14

孔琪(1989-),女,在读硕士,研究方向:代谢组学。

*通讯作者:余正文(1973-)，男，博士，教授，研究方向：植物化学。

国家自然科学基金(31060056);国家自然科学基金(31460068)；贵州省科技基金项目(黔科合J字[2011]2368号);贵州省中药现代化专项(黔科中药字[2011]5046号)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)05-0087-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.009