李新华,齐晓军,闫 荣,钱丹丹,于金跃

(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)



玉米麸质粉中残留淀粉分离技术方法与机理研究

李新华,齐晓军,闫 荣,钱丹丹,于金跃

(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

对玉米麸质用尿素、吐温80、NaCl、L-半胱氨酸水溶液浸泡4、8、12h,碘显色法测定处理后麸质中游离淀粉的含量,并采用光学显微镜对处理后的麸质中分子间的结构进行分析。经光学显微镜观察,直观地看出尿素、吐温80、NaCl、L-半胱氨酸均可使与蛋白质紧密结合的淀粉颗粒游离出来,且主要是体积较小的角质区淀粉颗粒。实验说明玉米麸质中的淀粉主要以二硫键与蛋白质结合,但还有通过静电引力、疏水作用和氢键结合的淀粉。

玉米麸质,二硫键,静电引力,氢键,疏水作用

玉米麸质粉(Corn Gluten Meal,CGM)是湿法生产淀粉时分离出的副产物。玉米麸质粉主要用做饲料[1-3],也可用于提取醇溶蛋白[4-5]、谷蛋白[6]与黄色素[7-8]。麸质中除蛋白质外,还有一定比例的结合淀粉,这部分难以提取出来的淀粉,与蛋白质存在着特定的结构形式,目前玉米的湿法生产工艺很难使之分离,国外一些研究发现,淀粉与蛋白质之间的复合不是由单一作用完成的,而是共价键、静电力、范德华力、氢键、疏水作用、离子键、容积排阻作用及分子缠绕等综合作用的结果,玉米湿磨工艺在很大程度上打破了这种结合,而留存在麸质粉中的淀粉其结合强度显然更大,如何打破这种结合,实现玉米淀粉与蛋白质的完全分离,国内外研究报道较少。化学试剂与淀粉或蛋白质分子间的作用有利于破坏淀粉-蛋白质之间、蛋白质之间的作用力[9]。本文以麸质粉为试材,采用化学试剂法测定麸质中淀粉与蛋白质作用力,借助光学显微镜观察化学试剂处理前后玉米麸质中淀粉和蛋白质结构的变化,为提取玉米麸质粉中的淀粉以及获得纯度更高的玉米蛋白粉提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米麸质粉 购于鲁州生物科技(辽宁)有限公司,经过筛处理成60目的粒状麸质;可溶性淀粉 市售;尿素、吐温80、NaCl、L-半胱氨酸(L-Cys)、Ca(NO3)2、I2、KI 均为市售,分析纯。

TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;EL-204电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 金云市杰瑞尔电器有限公司;金相显微镜BX41 日本OLYMPUS;高速冷冻离心机himac CR-21G 北京安捷来勒科技有限公司;真空干燥箱 北京恒泰丰科实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 麸质的处理 称取1g麸质,分别用200mL的水(空白)、尿素(1%、2%、4%)、吐温80(3%、5%、8%)、NaCl(3%、5%、8%)、L-半胱氨酸(1%、2%、3%)水溶液在28℃(该温度维持蛋白质与淀粉良好的结构与性质)水浴锅中浸泡4、8、12h,将同一时间段处理完的麸质离心(8000r/min,4min,4℃),弃上清液,残渣用蒸馏水悬浮洗涤、离心两次,残渣备用。

1.2.2 玉米麸质粉的主要成分检测

1.2.2.1 玉米麸质粉淀粉含量测定 分光光度法。

1.2.2.2 玉米麸质粉蛋白质含量测定 参照 GB 5009.5-2010食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定。

1.2.2.3 玉米麸质粉水分含量测定 参照 GB 5009.3-2010 食品安全国家标准 食品中水分的测定。

1.2.2.4 玉米麸质粉脂类含量测定 参照 GB 5009.3-2010 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定。

1.2.4 光学显微镜观察 麸质处理如1.2.1,将离心后的残渣加入等量的水,搅匀,用移液枪取1mL放在载玻片上,用碘-碘化钾法染色,染色后淀粉颗粒成蓝色,蛋白质成黄色。于4×100倍显微镜下观察化学试剂处理前后麸质颗粒的宏观变化并拍照。

1.3 数据分析

运用SPSS Statistics17.0等软件对数据进行分析。简单的分析和作图用Excel、Word软件。

2 结果与分析

2.1 游离淀粉含量测定标准曲线

从图1可以看出,碘显色法测淀粉的吸光度得其线性回归方程:Y=0.0113X-0.003,r=0.9997。

图1 淀粉的标准曲线Fig.1 Standard curve of starch

2.2 玉米麸质粉中主要成分及含量

玉米麸质粉中主要成分及含量如表1，玉米麸质粉中主要成分为蛋白质、其次是淀粉。

表1 玉米麸质粉中主要成分及含量(%)Table 1 The main composition and content in CGM(%)

2.3 化学试剂对玉米麸质粉中蛋白质与淀粉结构的影响

采用不同化学试剂处理玉米麸质粉,测定处理后试样中游离淀粉的含量,游离淀粉含量越多,说明该试剂对其结构作用强度越大。

2.3.1 尿素处理对麸质粉中蛋白质与淀粉结构的影响 由图2可示,麸质经1%、2%、4%浓度的尿素处理,浸泡4、8、12h时麸质中游离出来的淀粉含量大于水处理,且随着浸泡时间、浸泡试剂浓度的增加,游离出来的淀粉的量也增加,且4%尿素处理效果最好,游离出来的淀粉含量变化差异显著(p<0.05)。

图2 不同浓度尿素处理后麸质中游离淀粉含量Fig.2 The content of free starch in gluten treated with urea in different concentrations

2.3.2 吐温80处理对麸质粉中蛋白质与淀粉结构的影响 由图3可示,麸质经3%、5%、8%浓度的吐温80处理,以水为空白对照,4、8、12h时麸质中游离出来的淀粉含量大于水处理,且随着浸泡时间的增加,经水、吐温80处理游离出来的淀粉的量也增加,且5%吐温80处理效果最好,麸质中游离出来的淀粉含量变化差异显著(p<0.05)。

图3 不同浓度吐温处理前后麸质中游离淀粉含量Fig.3 The content of free starch in gluten treated with Tween 80 in different concentrations

2.3.3 氯化钠处理后游离淀粉的含量 由图4可知,麸质经3%、5%、8%浓度的NaCl处理,4、8、12h时麸质中游离出来的淀粉含量大于水处理,且随着浸泡时间的增加,经水、NaCl处理游离出来的淀粉的量也增加,且8% NaCl处理效果最好。麸质中游离出来的淀粉含量变化差异显著(p<0.05)。

图4 不同浓度NaCl处理前后麸质中游离淀粉含量Fig.4 The content of free starch in gluten treated with NaCl in different concentrations

2.3.4L-半胱氨酸处理后游离淀粉的含量 由图5可示,麸质经1%、2%、3%浓度的L-半胱氨酸处理,以水为空白对照,4、8、12h时麸质中游离出来的淀粉含量大于水处理,且随着浸泡时间的增加,经水、L-半胱氨酸处理游离出来的淀粉的量也增加,且3%L-半胱氨酸处理效果最好。麸质中游离出来的淀粉含量变化差异显著(p<0.05)。

图5 不同浓度L-半胱氨酸处理前后麸质中游离淀粉含量Fig.5 The content of free starch in gluten treated with L-cysteine in different concentrations

2.4 不同化学试剂处理结果比较

对麸质粉浸泡12h,处理效果最好的4%尿素、5%吐温80、8% NaCl、3%L-半胱氨酸与水做对比再次进行实验,结果如图6可示。

图6 不同试剂处理麸质12h后游离出来的淀粉含量Fig.6 The content of free starch in gluten treated with different reagents for 12h

图6表明,四种化学试剂处理麸质游离出来的淀粉含量为3%L-半胱氨酸>8% NaCl>5%吐温>4%尿素。分析认为,L-半胱氨酸破坏麸质中二硫键能力较强,NaCl破坏麸质中静电引力较强,尿素破坏麸质中氢键和疏水作用较弱,吐温破坏麸质中疏水作用较弱。

2.5 光学显微镜观察

在100倍物镜下,可以清晰的观察到经4%尿素、5%吐温、8% NaCl、3%L-半胱氨酸水溶液浸泡12h的显微图片如图7所示。

图7 100倍物镜下不同化学试剂处理前后麸质的显微图片Fig.7 Photomicrograph under 100 times lens of gluten before and after treated with different reagents

图7观察到黑色的是淀粉颗粒,灰色的是蛋白质颗粒。可以看出用试剂处理前,麸质中的蛋白质颗粒与淀粉颗粒连接非常紧密,相互嵌合,且蛋白质颗粒大小差异不大,结构紧密,蛋白质相互粘连,重叠,蛋白质颗粒间空隙小,晶体外形排列整齐,淀粉与蛋白质相互粘连,重叠,淀粉颗粒比较大(图7a)。经4%的尿素处理,麸质中的蛋白质颗粒与淀粉颗粒连接不紧密,排列明显疏松,视野中的蛋白质颗粒排列明显疏松,碎片较多,以大碎片为主,呈无序状态,麸质颗粒之间空隙增大,晶体外形排列不整齐,淀粉颗粒游离出来,且颗粒比较小(图7b)。经5%吐温处理,麸质中的蛋白质颗粒与淀粉颗粒连接不紧密,有淀粉颗粒与蛋白质粘连,有淀粉颗粒完全游离出来,有的还被蛋白质颗粒完全包裹,视野中的蛋白质碎片较多,以大碎片为主,游离出来的淀粉颗粒成椭圆形,且颗粒较小(图7c)。经8%氯化钠处理,麸质中的淀粉颗粒与蛋白质颗粒连接非常不紧密,视野中蛋白质与淀粉颗粒碎片较多,蛋白质碎片以小碎片为主,视野中的淀粉颗粒较小,有的不是椭圆形(图7d)。经3%L-半胱氨酸处理,淀粉颗粒与蛋白质颗粒连接不紧密,淀粉颗粒从蛋白质颗粒之间游离出来,麸质颗粒间空隙增大,排列疏松,呈无序状态,晶体外形排列不整齐,游离出来的淀粉颗粒呈椭圆形,颗粒比较小(图7e)。显微观察只能看出未处理麸质与化学试剂处理后麸质颗粒的宏观变化,更为细致的颗粒变化会进一步研究观察。

3 讨论

3.1 麸质粉中存在淀粉与蛋白质的氢键结合

有文献记载,尿素能够通过与溶质直接相互作用、改变溶质水化层、改变水分子体积结构或其综合作用增加极性和非极性溶质在水溶液中的溶解性[12],用尿素浸泡麸质时,由于尿素分子中的氢原子与蛋白质肽链中的氧原子相作用而形成氢键,这样使肽链自身可形成的氢键减少,使多肽分子中靠氢键维系的二级结构如螺旋、折叠、自由回转结构遭到破坏,使麸质中的蛋白分子伸展变性溶解,从而使与蛋白质相结合的淀粉游离出来,尿素的浓度越大,尿素溶液中氢原子越多,与麸质中氧原子结合形成氢键越多,对靠氢键维系的二级结构破坏越大,从而使与蛋白质复合的淀粉游离出来也越多。有文献记载,具有盐溶效应的尿素还能使溶剂体系的溶剂促簇能力降低,使临界胶束浓度增大,破坏疏水相互作用,从而使簇集者的簇集倾向性减少[12]。实践与理论分析表明,尿素通过破坏蛋白质之间的氢键结构和疏水相互作用强烈地影响蛋白质分子-淀粉分子低温下的相互作用,使体系的弹性、弛豫时间和单一的松弛过程降低。本实验结果证实了在麸质粉中的难分离淀粉与蛋白质的结合仍符合上述规律,但靠打破氢键释放出来的游离淀粉量相对较少,说明在麸质粉中氢键结合的淀粉比例较小。

3.2 麸质粉中的静电力与疏水作用

吐温80为非离子型表面活性剂,表面活性剂由两部分构成:一部分是非极性的疏水基,另一部分是极性的亲水基,疏水相互作用是通过疏水物的疏水基于水相互排斥作用而发生的,它对大多数蛋白质的结构和性质非常关键,蛋白质同时含极性和非极性的基团,当蛋白质处于吐温80水溶液中时,极性基团之间以及极性基团与吐温80水溶液之间易发生静电吸引而排开非极性水基团。实践与理论分析表明吐温80正是通过疏水基插入蛋白质疏水空腔,打乱疏水区的平衡,破坏蛋白质结构,从而使淀粉与蛋白质之间的相互作用降低,淀粉游离出来。

静电引力是由万有引力引起,金属离子Na+能使蛋白质极性表面脱水,增加蛋白质分子间引力,同时减少蛋白质分子间负电荷排斥作用,改变大分子构象稳定,促进蛋白质分子发生疏水聚集[13-14],蛋白质表面疏水作用力下降,从而同时降低了与淀粉分子之间的静电引力。实践与理论分析表明NaCl正是破坏了蛋白质表面的疏水作用力,从而使蛋白质与淀粉之间的静电引力下降,淀粉游离出来。

本实验中依靠打破疏水作用和静电力作用释放出来的游离淀粉含量相近,但都大于打破氢键力释放出来的游离淀粉量,说明静电力和疏水作用还是麸质粉中淀粉与蛋白质结合的主要因素。

3.3 麸质粉中的二硫键结合力

二硫键为一个半胱氨酸的-SH与同链或邻链另一半胱氨酸的-SH氧化连接而成,是蛋白质分子中的重要化学键,L-半胱氨酸分子中含有具有还原性的巯基(-SH),且L-半胱氨酸破坏二硫键能力较强[15-16];加入2%L-半胱氨酸,L-半胱氨酸中-SH可以与蛋白质中的二硫键的一个半胱氨酸的-SH竞争,从而破坏蛋白质中的二硫键,破坏了蛋白质的二硫键,可使蛋白质分子结构松懈,从有规则的紧密结构变为开链的不规则和散漫的排列形式。实践与理论分析表明,L-半胱氨酸正是通过破坏麸质中蛋白质的二硫键,使蛋白质结构不规则,从而破坏了蛋白质与淀粉之间的作用力,使淀粉游离出来。本实验依靠打破蛋白质与淀粉之间的二硫键释放出来的游离淀粉量最大,说明在麸质粉中难分离的淀粉仍以二硫键与蛋白质结合,要最大限度地分离麸质粉中的淀粉,应采取克服二硫键结合的技术方法。

4 结论

不同化学试剂处理麸质游离出来的淀粉含量为:3%L-半胱氨酸>8% NaCl>5%吐温>4%尿素,经光学显微镜观察,直观的看出尿素、吐温、NaCl、L-半胱氨酸均可使与蛋白质紧密结合的淀粉颗粒游离出来,且主要是体积较小的角质区淀粉颗粒。实验说明玉米麸质中的淀粉主要以二硫键与蛋白质结合,但还有通过静电力、疏水作用和氢键结合的淀粉,要最大程度地分离麸质粉中的淀粉,首先应采用打破二硫键的技术方法,并要兼顾采用其他分离工艺。

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Study on separation technology method and mechanism ofresidual starch in corn gluten powder

LI Xin-hua,QI Xiao-jun,YAN Rong,QIAN Dan-dan,YU Jin-yue

(College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Corn glute was soaked with urea,Tween 80,NaCl,L-cysteine solution for 4,8 and 12h,the content of free starch in treated gluten was measured by the method of iodine colorimetric,and the structure among the molecules in treated gluten was analyzed by optical microscope. Through optical microscope,it was intuitive to see starch kernels that bind to proteins,especially small volume cutin starch granule,free from protein,which was made by urea,Tween 80,NaCl,andL-cysteine. The study showed that the key force between starch in corn gluten and proteins was disulfide bonds,but electrostatic attraction,hydrophobic effect and hydrogen bond also exited.

corn gluten;disulfide bonds;electrostatic attraction;hydrogen bond;hydrophobic effect

2014-05-19

李新华(1955-),男,博士,教授,研究方向:粮油加工与转化。

国家自然科学基金面上项目(31171782)。

TS231

A

1002-0306(2015)05-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.003